H^+K^+-ATPase α-subunit遺伝子転写におけるERKの役割

ERK 在 H^+K^+-ATPase α 亚基基因转录中的作用

• 批准号: 11770283
• 负责人: 竹内 義明
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Showa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11770283/
• 关键词: ERKs; H^+K^+-ATPase; EGF

Extracellular signal regulated protein kinases(以下ERKs)の胃壁細胞での酸分泌における役割を検討するにあたり、MDCK細胞を購入しDMEMにて培養した。この細胞では,外来的に導入されたHK ATPaseα subunit遺伝子のプロモーターがEGF刺激により活性化されることがすでに明らかにされている。はじめにEGF刺激によるERKs活性化を検討するため、同細胞を異なった時間、EGFで刺激した。cell lysateを作成し,抗リン酸化ERK抗体を用いたwestern blotにて活性化を検討したところ、20分刺激で最も強い活性が得られ、以後活性は時間と共に失われ時間依存性が確認された。同様に異なった濃度のEGFで刺激したところ、10nMで最も強い活性が得られ、濃度依存性も確認された。次にERK kinseであるMEK1の阻害剤PD98059を用いて、EGFによるERKs活性化の抑制効果を検討した。MDCK細胞を異なった濃度のPD98059でプレインキュベーションして、EGFで刺激したところ、30μMにて70〜80%の抑制効果が得られた。しかしながら10μMでも約50%の抑制効果は得られた。次にMDCK細胞にレポーターベクターを外来的にトランスフェクションすることを試みた。導入にはリポフェクション法を用いた。細胞数、プラスミドDNA量、リポフェクション試薬量の3因子の最適条件を決めるため、ルシフェラーゼのコントロールベクターを購入し、おのおの3因子の条件を変えて検討した。4μgのDNAと12μlのリポフェクション試薬が50000の細胞数に最適であった。今後は同細胞にHK ATPase α subunit遺伝子のプロモータ-組み込んだレポーターベクターを導入する予定である.

Extracellular signal regulated protein kinases(ERKs) were cultured in DMEM. These cells are activated by exogenous HK ATPaseα subunit gene. EGF-stimulated ERKs activation in the same cell at different times Cell lysate was prepared and anti-ERK antibody was activated by western blot. The highest activity was obtained after 20 minutes stimulation, and the time dependence of activity was confirmed after 20 minutes stimulation. The activity of EGF was highest at 10nM and concentration-dependent at different concentrations. Next, ERK kinse and MEK1 inhibitor PD98059 were used to investigate the inhibitory effects of EGF on ERKs activation. MDCK cells were stimulated by EGF at different concentrations of PD98059 and inhibited by 70 ~ 80% at 30μM. About 50% of the inhibition effect was obtained at 10μM. The second is MDCK Cell. The second is MDCK Cell. The introduction of the new method is described below. The optimal conditions for determining the cell number, DNA quantity and concentration of the three factors were discussed. 4μg DNA and 12μl DNA were optimal for the assay with 50000 cells. In the future, the HK ATPase α subunit gene will be introduced into the same cell.