H^+K^+-ATPase α-subunit遺伝子転写におけるERKの役割

Extracellular signal regulated protein kinases(以下ERKs)の胃壁細胞での酸分泌における役割を検討するにあたり、MDCK細胞を購入しDMEMにて培養した。この細胞では,外来的に導入されたHK ATPaseα subunit遺伝子のプロモーターがEGF刺激により活性化されることがすでに明らかにされている。はじめにEGF刺激によるERKs活性化を検討するため、同細胞を異なった時間、EGFで刺激した。cell lysateを作成し,抗リン酸化ERK抗体を用いたwestern blotにて活性化を検討したところ、20分刺激で最も強い活性が得られ、以後活性は時間と共に失われ時間依存性が確認された。同様に異なった濃度のEGFで刺激したところ、10nMで最も強い活性が得られ、濃度依存性も確認された。次にERK kinseであるMEK1の阻害剤PD98059を用いて、EGFによるERKs活性化の抑制効果を検討した。MDCK細胞を異なった濃度のPD98059でプレインキュベーションして、EGFで刺激したところ、30μMにて70〜80%の抑制効果が得られた。しかしながら10μMでも約50%の抑制効果は得られた。次にMDCK細胞にレポーターベクターを外来的にトランスフェクションすることを試みた。導入にはリポフェクション法を用いた。細胞数、プラスミドDNA量、リポフェクション試薬量の3因子の最適条件を決めるため、ルシフェラーゼのコントロールベクターを購入し、おのおの3因子の条件を変えて検討した。4μgのDNAと12μlのリポフェクション試薬が50000の細胞数に最適であった。今後は同細胞にHK ATPase α subunit遺伝子のプロモータ-組み込んだレポーターベクターを導入する予定である.

Extracellular signal regulated protein kinases(以下ERKs)の胃壁細胞での酸分泌における役割を検討するにあたり、MDCK細胞を購入しDMEMにて培養した。この細胞では,外来的に導入されたHK ATPaseα subunit遺伝子のプロモーターがEGF刺激により活性化されることがすでに明らかにされている。はじめにEGF刺激によるERKs活性化を検討するため、同細胞を異なった時間、EGFで刺激した。cell lysateを作成し,抗リン酸化ERK抗体を用いたwestern blotにて活性化を検討したところ、20分刺激で最も強い活性が得られ、以後活性は時間と共に失われ時間依存性が確認された。同様に異なった濃度のEGFで刺激したところ、10nMで最も強い活性が得られ、濃度依存性も確認された。次にERK kinseであるMEK1の阻害剤PD98059を用いて、EGFによるERKs活性化の抑制効果を検討した。MDCK細胞を異なった濃度のPD98059でプレインキュベーションして、EGFで刺激したところ、30μMにて70〜80%の抑制効果が得られた。しかしながら10μMでも約50%の抑制効果は得られた。次にMDCK細胞にレポーターベクターを外来的にトランスフェクションすることを試みた。導入にはリポフェクション法を用いた。細胞数、プラスミドDNA量、リポフェクション試薬量の3因子の最適条件を決めるため、ルシフェラーゼのコントロールベクターを購入し、おのおの3因子の条件を変えて検討した。4μgのDNAと12μlのリポフェクション試薬が50000の細胞数に最適であった。今後は同細胞にHK ATPase α subunit遺伝子のプロモータ-組み込んだレポーターベクターを導入する予定である.