βカテニンチロシンキナーゼの同定

β-连环蛋白酪氨酸激酶的鉴定

基本信息

  • 批准号:
    13770274
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.28万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
  • 财政年份:
    2001
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2001 至 2002
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

ヒトβ-カテニンのクローニングをPCR法を用いて行ったが、cDNAの塩基配列に異常を認めたためsite directed mutagenesis法にてより修正を行った。得られたβカテニンc-DNAを制限酵素で切断し、それらをGST-fusion proteinを発現するベクターであるpGEXベクターに組込んだ。それぞれのベクターで大腸菌DH5αをトランスフォーメーションし、IPTGの存在下に大腸菌を増殖させた。大腸菌をdetergentを含むlysis bufferにて溶解し、その可溶化液をpolyacrylamide gel(SDS-PAGE)に展開し、抗βカテニン抗体を用いたwestern blotにてGST融合蛋白質の発現を確認した。しかしながらからpGEXベクターへのサブクローニングに難渋し、また大腸菌の溶解条件が適切でなくwestern blotにて純度の高い融合蛋白質がなかなか得られなかった。諸条件を決定ののち、適切なpGEXベクターを有する大腸菌を培養し、途中でIPTGを加えさらに培養して大量に得た。これをlysis bufferにて溶解し、可溶化液をSDS-PAGEにて蛋白質の発現を確認した。次に融合蛋白質の精製のためaffinity chromatographyを行った。glutathione agarose beadsを大腸菌可溶化液とインキュベーションし、このビーズをPBSで数回洗浄ののちelution bufferでさらにインキュベーションした。elutionを数回行いSDS-PAGEを施行したが溶出効率が悪く、ビーズをsepharoseに変更しelution bufferも条件を変えた。今後は得られた融合蛋白質をSDS-Polyacrylamidegelとco-polymerizeさせる。胃癌細胞株MKN7、MKN28、MKN45、Kato-IIIよりそれぞれ細胞可溶化液を得て、それらを同ゲルに泳動する。ゲルを還元剤使用の後、泳動された蛋白質をグアニジン塩酸にて一旦変性させ、のち再生させて32Pとともにインキュベーションする。その後ゲルを洗浄、乾燥させ、オートラジオグラフィーに供する予定である。
ヒ ト beta カ テ ニ ン の ク ロ ー ニ ン グ を を PCR method with い て line っ た が, cDNA の salt base with column に abnormal を recognize め た た め site directed mutagenesis method に て よ り fixed line を っ た. Have ら れ た beta カ テ ニ ン c - を で cut し limited enzyme, DNA そ れ ら を GST - fusion protein を 発 now す る ベ ク タ ー で あ る pGEX ベ ク タ ー に group 込 ん だ. そ れ ぞ れ の ベ ク タ ー で coliform DH5 alpha を ト ラ ン ス フ ォ ー メ ー シ ョ ン し, IPTG の に in the presence of coliform を raised colonization さ せ た. Coliform を detergent contains を む lysis buffer に て dissolved し, そ の solubilization liquid を polyacrylamide gel (sds-page) に し and resistance to beta カ テ ニ を ン antibody with い た western blot に て GST fusion protein の 発 を now confirmed し た. し か し な が ら か ら pGEX ベ ク タ ー へ の サ ブ ク ロ ー ニ ン グ に difficult 渋 し, ま た coliform の が dissolving conditions appropriate で な く western blot に て の high purity い fusion protein が な か な か have ら れ な か っ た. Conditions を decided の の ち, appropriate な pGEX ベ ク タ ー を have す る coliform を し, en で IPTG を plus え さ ら に cultivate し て large に た. <s:1> れをlysis bufferにて dissolves にて, soluble solution をSDS-PAGEにて protein <s:1> occurrence を confirms た た. The に fusion protein <s:1> refining ためaffinity chromatographyを rows った. Glutathione agarose beads を coliform can melt fluid と イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し, こ の ビ ー ズ を PBS で incorporated several back の の ち elution buffer で さ ら に イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た. Elution を number return い sds-page を imposed し た が dissolution rate of unseen が 悪 く, ビ ー ズ を sepharose に - more し elution buffer を も conditions - え た. In the future, られた fusion protein を SDs-polyacrylamide gelとco-polymerizeさせる will be obtained. Gastric cancer cell lines MKN7, MKN28, MKN45, Kato - III よ り そ れ ぞ れ cells can be melted liquid を て, そ れ ら を with ゲ ル に swimming す る. ゲ ル を yuan tonic after using の, swimming さ れ た protein を グ ア ニ ジ ン acid salt に て once - sex さ せ, の ち regeneration さ せ て 32 p と と も に イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン す る. After そ の ゲ ル を, drying at さ せ, オ ー ト ラ ジ オ グ ラ フ ィ ー に for す る designated で あ る.

项目成果

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