权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

Wilson病銅輸送ATPaseの組織内局在の検討

威尔逊病铜转运 ATP 酶的组织定位检查

基本信息

批准号：
11770432
负责人：
山口之利
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Toho University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 2000
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11770432/
关键词：
Wilson病 ATP-7B 銅輸送ATPase

项目摘要

ヒトWilson病の遺伝子を用いて、蛋白を合成しそれに対するポリクローナル抗体を作製、精製した。具体的には構造遺伝子上6つある銅結合部位のうち4から6までにわたって遺伝子をサブクローニングし大腸菌の発現ペクター(expression vector)に組み入れ蛋白を合成した。その蛋白をニトロセルロース膜に電気泳動し、溶出した溶液を野兎に免疫(合計3回)し、その血清からポリクローナル抗体を得た。抗体を用いて培養細胞(Hepg2 cell)の蛍光抗体を用いた免疫組織染色を行ったところおもにゴルジ体からエンドソームにかけてWilson病の蛋白の局在が認められた。これはマンノース6リン酸受容体蛋白などのtrans Golgi networkを中心とする膜蛋白の分布と一致し興味深い。さらに抗体の特異度を高めるためにprotein A beadsを用いたaffinity purificationを行い使用したところ、上述した部位にさらにシャープな局在が認められた。またWilson病患者の生検肝5検体と正常コントロール肝2検体をInformed concentを得たうえで免疫組織染色を行った。Wilson病患者の肝臓は肝硬変が進行しておりシグナルに特異性は認めなかった。正常コントロール肝では細胞内に集積が認められたが核周囲から細胞質全体に広がりHepG2 cellほどの特異性はみられなかった。これに対してヒトアルブミンなどを用いてblocking(全処置)を工夫したが難航した。これは背景シグナルの除去の安定化に問題があり、除去が困難な場合抗体特異性の面からモノクローナル抗体の作製が組織におけるWilson病蛋白の正確な局在を調べる上で必要と考えられた。

It is produced and refined using いて and protein synthesis しそれに対するポリクローナルantibody. The specific structure of the には structure is the 6 つある copper joint part のうち 4 から 6 までにわたって伝子をサブクローニングし coliform bacteria now ペクター(expression vector) is assembled into the protein and synthesized.そのprotein をニトロセルロース membrane にelectrophoresis し、dissolution したsolution を野兎にimmunization (total 3 times), そのserum and からポリクローナルantibody をget. Antibody cultured cells (Hepg2 cell) immunohistochemical staining using immunohistochemical staining The body's disease is the protein of Wilson's disease.これはマンノース6 リン acid receptor protein などのtrans Golgi network を center とする membrane protein の distribution とし interesting deep い. The specificity of antibodies is high, protein A beads are used, and affinity is used The purpose of purification is to use したところ, and the above した parts are to be used.またWilson's disease patient's liver 5 検 body と normal liver 2 検 body を Informed concentration を got たうえで immune tissue staining を row った. In patients with Wilson's disease, liver cirrhosis and liver cirrhosis are diagnosed in a specific and specific manner. Normal Hepatic Intracellular Accumulation HepG2 cell specificity はみられなかったこれに対してヒトアルブミンなどを Use いてblocking (all disposal) を Time and space are difficult to navigate. Antibody background, stabilization problem, removal difficulty, antibody specificity, antibody specificity, etc. It is necessary and necessary to ensure that the correct structure of the antibody and the Wilson's disease protein are produced and tested.