In Situ PCR法による糸球体領域に発現する一酸化物合成酵素mRNAの検討

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Nitric oxide(NO)は生物学的活性を有する一酸化物で、腎内にもNO合成酵素(NOS)の各isoformの存在が確認されている。一方、carbon monoxide (CO)は、hemoglobin由来のhemeから、そのdegradation enzymeであるheme oxygenaseにより作られる。COはNOと同様にcyclic GMPを介する生理作用を有し、やはり腎での発現が確認されており、血行動態、腎機能への影響が検討されている。今回は特に糸球体領域の両合成酵素のmRNA発現を組織上で観察する目的で、In situ PCR法を検討した。同法は、PCR法をそのまま組織切片上で施行し、特定のDNAの同定を行う方法である。Reversetranscriptionを併用することにより、mRNAの発現も検討が可能である。高血圧を発症するDOCA-salt負荷ラットモデルにおいて経時的に、組織障害の程度と発現を観察した。eNOSの染色発現は顕著に低下した。HO-IIは血管内皮での存在が指摘されているが、糸球体領域ではまだ確認されていないため、糸球体部でのmRNAをIn situ PCR法で確認した。In situ PCR法の確立 1,腎組織の凍結プレパラートを作製、標本をプロテアーゼおよびRNase free DNase処理をする。2,reversetranscriptaseによりfirst strand cDNAを合成する。3,サンプルブロックに装着して、PCR reagentを加える。PCR産物を可視化するためにdigoxigenin標識のdUTPを基質として加える。4,反応終了後、抗digoxigenin抗体で染色する。糸球体内tuft内のHO-IIの発現は、モデルラットで低下するものが認められたが、非特異的なシグナルも多く、今後の課題と考えられた。