新規マーカータンパク質Gas1pを用いた酵母エンドサイトーシス経路の解析

使用新型标记蛋白 Gas1p 分析酵母内吞途径

• 批准号: 11771464
• 负责人: 平田 龍吾
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11771464/
• 关键词: 細胞膜; 液胞; 小胞輸送; 酵母; エンドサイトーシス; PMA1; GAS1; VMA1

酵母におけるエンドサイトーシスの解析に用いるための新規なマーカータンパクの候補としてGas1pを同定した。Gas1pは、酵母における主要なGPIアンカータンパク質である。昨年度までの解析で、Gas1pの大部分は細胞膜に局在し、細胞膜からの取り込みは低いという結論を得たが、同じく安定に細胞膜に存在する膜タンパク質であるPma1pとの間に異なる性質が認められたので、この点について解析した。液胞型ATPase(V-ATPase)は、分泌経路上の細胞内小器官の内腔酸性化に機能するプロトンポンプである。V-ATPaseのサブユニットの欠失変異株(vma1)では、Pma1pの細胞内定常状態量が野生株の1/2程度に低下していた。一方、Gas1pの定常状態量は影響を受けなかった。N末にHAタグを挿入した組換えPma1pを発現する株を構築し、抗HA抗体を用いた間接蛍光抗体法でPma1pの局在性を検討したところ、vma1変異株ではPma1pに由来するの細胞膜の染色が弱くなり、野生株には認められない液胞膜の染色が認められた。変異株におけるPma1p存在量の低下は液胞内プロテアーゼの欠失株で見かけ上抑圧されたことから、vma1変異株ではPma1p-HAの一部が液胞に誤輸送され、液胞内プロテアーゼによって分解を受けていると結論した。Pma1pの液胞への誤輸送は、野生株をV-ATPaseの選択的阻害剤であるfolimycinで処理した場合にも認められた。そこで、Folimycin処理を様々な分泌変異株と組み合わせてPma1pの液胞への蓄積を間接蛍光抗体法で検討し、Pma1pの誤輸送経路について検討した。Sec18pやVps27pなど、液胞膜タンパク質の細胞内輸送に必要なタンパク質の変異は、folimycin処理によるPma1pの液胞への蓄積を阻害した。一方で、ゴルジから細胞膜への輸送に必要なSec6pや、エンドサイトーシスに必要なEnd3pの変異株では、野生株と同様にPma1pの液胞への誤輸送が観察された。以上の結果から、Pma1pは、細胞膜に出現することなく、ゴルジ体から直接液胞に輸送されると考えられた。

Yeast Gas1p, yeast In the past year, most of Gas1p's cell membrane was found to be stable, and the cell membrane was found to be stable. The properties of Gas1p were different. V-ATPase plays a key role in the acidification of intracellular small organs along the secretory pathway. V-ATPase activity was lower than that of wild plants (vma1) and Pma1p was lower than that of wild plants (vma 1). A party, Gas1p and the steady state quantity are affected. The expression of Pma 1p in the wild was detected by indirect light antibody method. The results showed that the Pma1p content in the mutant plants was lower than that in the control plants, and the Pma1 p content in the mutant plants was lower than that in the control plants. Pma1p cell mis-transport, wild plant V-ATPase selective inhibition agent, folimycin treatment The accumulation of Pma1p in cells was detected by indirect light antibody method, and the mis-transport pathway of Pma1p was detected. Sec18p and Vps27p are essential for intracellular transport of cytosol, and Pma1p accumulation is inhibited by folimycin treatment. In one case, it is necessary to detect the wrong transport of cell membrane in different strains, wild strains and similar Pma1p. The above results show that Pma1p is the most important factor in cell membrane transport.