ダイオキシンの毒性発現に関与する遺伝子の検索

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平成12年度においては、3T3-L1細胞の脂肪細胞分化におけるTCDDの阻害作用機序を明らかにする目的でTCDDによる3T3-L1細胞の分化抑制作用に関連した細胞内情報伝達ならびに遺伝子発現の変化を検討した。3T3-L1細胞の脂肪細胞への分化誘導は常法に従い行った。Rbタンパク質ならびに関連タンパク質の検出はウエスタンブロッティング法により行った。TCDD処理による遺伝子発現の変化はPCR-サブトラクション法(Clontech)を用いて行い、得られたクローンの発現量の再確認はリバースノーザン法を用いて行った。MAPKならびにJNK活性の測定は免疫沈降後行った。コントロール細胞において分化誘導剤添加48時間後に細胞増殖(clonal expansion)が観られたが、この際10nM TCDDを添加することにより細胞増殖は観察されず、その後の分化も抑制された。そこで分化誘導剤添加24時間後にTCDDを暴露し48時間後にRNAを抽出してサブトラクション法により検討した。その結果TCDDによる分化抑制にともない発現量が変化し、かつTCDDが毒性を示さない条件下(分化誘導剤添加78時間以降におけるTCDDの暴露)では変化を示さないクローンを単離した。またTCDD処理により脂肪細胞分化にともなうRBタンパク質のリン酸化ならびにp107のdown-regulationが阻害された。さらにp42/p44MAP kinase活性を測定したところTCDD処理により活性の上昇が認められた。