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立体構造に基づく全長σ因子の複合体によるプロモーター認識機構の解明

基于3D结构的全长σ因子复合物阐明启动子识别机制

基本信息

批准号：
11780471
负责人：
岡田健吾
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、全長σ因子のプロモーター特異的なDNA認識機構、および酵素複合体としてどのように相互作用し機能を発揮しているのかを、X線回折法により詳細な立体構造を得て、原子レベルで解明することを目的とした。平成11年度は、解析に適した単結晶を得ることを目標とした。効率のよい蛋白質の発現と精製の手順は確立できたが、σ因子あるいはσ因子と合成DNAとの複合体での結晶化は、広範な検索を行ったが成功しなかった。次に、σ因子と強く相互作用して複合体を形成するanti-σ因子に着目し、蛋白質複合体としての発現と精製条件を詳細に検討し、結晶化に適した高純度の標品を得ることが可能となった。平成12年度は、得られた単結晶から立体構造解析を進める予定であったが、平成11年度中に解析に適した単結晶を再現性よく得ることができなかったため、σ因子とanti-σ因子の複合体による結晶化条件の検索を続行した。現在までに、全長σ因子とそのanti-σ因子の複合体の単結晶を再現性よく得ることに成功している。ただし、結晶のサイズが大変小さく、放射光を用いなければ解析を進めることが不可能であるため、より大きな単結晶の作成を試みている。放射光を利用した場合、現状の単結晶のサイズ(20ミクロン程度)でも、複合体の回折強度データを集めることに成功した。今後、継続して位相決定のための重原子置換体あるいはSe-Met置換体の調製を行い、早期の構造解析の成功を目指す。

This study aims to identify specific DNA recognition mechanisms, enzyme complexes, and functional interactions of full-length sigma factors by X-ray backfolding and to obtain detailed three-dimensional structures and atomic solutions. In 2011, the company was founded. The synthesis of DNA complex by crystallization and purification of protein was successful. Second, sigma factor and strong interaction, complex formation, protein complex development, purification conditions, crystallization, high purity standards, etc. The analysis of three-dimensional structure in Heisei 12 was carried out in advance, and the analysis of three-dimensional structure in Heisei 11 was carried out in advance. Now, the whole length σ factor and anti-σ factor of the complex crystal reproducibility can be obtained successfully. For example, if you want to make a crystal, you can make a crystal. In the case of radiation utilization, the present situation of single crystal structure (20 ° C), the folding strength of complex structure and the collection of complex structure are successful. In the future, the phase determination and modulation of heavy atom substitutions and early structural analysis are indicated.