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時間分割X線構造解析による銅含有アミン酸化酵素のトパキノン生成機構の研究

利用时间分辨X射线结构分析研究含铜胺氧化酶产生托帕醌的机理

基本信息

批准号：
11780479
负责人：
山口宏
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Kwansei Gakuin University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

銅含有アミン酸化酵素中に存在するトパキノン補酵素の生成過程を明らかにするために反応中間体のモデル系や反応中間体の構造決定を液体窒素温度条件下のX線結晶解析法によって試みた。回折強度データの収集は、PFおよびSPring8のシンクロトロン放射光を用いて行った。まず、アポ型酵素に最初にCu^<2+>が結合する時の構造モデルとして、アポ型酵素にCu^<2+>の代わりにZn^<2+>、Co^<2+>、Ni^<2+>を結合させて結晶構造を決定した。その結果、各イオンは、トパキノン前駆体のTyr残基のOHと3つのHis残基で歪んだ四面体配位をとることが明らかになった。次に、Tyr残基と反応する酸素分子の初期的な結合部位を決定するために、Zn^<2+>を結合させたアポ型結晶を用い、Xeガスを10気圧で結晶に導入し、低温条件に移し構造解析を行った。その結果、Xe分子が金属結合部位から約7Å離れた疎水性領域に結合することを見いだし、酸素の初期結合部位であると推定した。次に、グローブボックス中で無酸素条件下でアポ型酵素結晶にCu^<2+>を結合させ、酸素飽和の母液に結晶を移して生成反応を開始させ、低温条件にすることにより反応中間体のトラップを試みた。結晶の顕微分光を行ったところ、幾つかの結晶でアポ型ホロ型とは異なった吸収スペクトルを示した。これらの結晶の回折強度データを収集し、電子密度の解析を行ったところTyr残基近傍に乱れた電子密度が観測され、反応初期の反応中間体の電子密度が現れたものと推定された。以上の結果より、初期的な反応の進行は、以下のように推定された。まずTyr残基が直接銅イオンの配位子となり、銅イオンが四面体構造をとる。次に金属結合部位の近傍に結合していた酸素が、銅イオンの結合後、His592のコンフォメーション変化により空いたスペースに移動し、銅イオン及びTyr残基と相互作用し反応が進行する。

In the acidified enzyme containing asphyxiant, the production process of the enzyme was determined by X-ray crystal analysis under the condition that the temperature of liquid asphyxiant was determined. The strength of the back refraction is different from that of the set, and the PF intensity is different from that of the SPring8. Cu ^ & lt;2+> enzymes were first combined with the time series to make the zinc ^ & lt;2+>, Co^ & lt;2+>, and Ni ^ & lt;2+> enzymes, respectively. The determination was made by combining the cu ^ & lt;2+> enzymes with the time series. The results showed that the Tyr residues of OH residues 3 and His residues were skewed and tetrahedral coordination compounds were clearly defined. The binding sites of secondary and Tyr residues in the early stage of the molecular reaction were determined by the combination of zinc, lt;2+>, zinc, zinc and zinc. The results showed that the metal binding site of Xe molecule was estimated to be sensitive to the metal binding site in the field of water and acid in the early stage of acid binding. Under the condition of no acid, under the condition of no acid, the combination of Cu ^ & lt;2+> and the transfer of acid and mother liquor resulted in the reaction of starting temperature, low temperature temperature and low temperature. The results show that the differential light spectrum is different from the other two, and the results show that the absorption spectrum is high. X-ray diffraction analysis, electron density analysis, electron density analysis, electron density The results of the above results, the initial reaction is in progress, and the following conditions are presumed to be satisfactory. The Tyr residue is directly linked to the ligand, the tetrahedron, and the tetrahedron. After the secondary metal bonding site was combined with sulfamethoxylate and sulfonic acid, the interaction between His592 and Tyr residues was reversed.