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極低温におけるグルタチオン合成酵素の反応中間体を含む状態での構造研究

极低温下含有反应中间体状态的谷胱甘肽合酶的结构研究

基本信息

批准号：
07780494
负责人：
山口宏
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780494/
关键词：
低温実験グルタチオン合成酵素結晶解析

项目摘要

大腸菌由来グルタチオン合成酵素のループ欠損変異型酵素の結晶構造を決定し、天然型酵素との生化学的データの比較によって、本酵素中のループ構造がスムーズな酵素反応進行に重要な役割を果たしていることを明らかにした。また反応中間体の解析の基礎データとして本酵素の基質複合体の構造を詳細に決定するために、液体窒素温度においてデータの収集ができる方法、条件を検索した。その結果、硫酸アンモニウムを沈殿剤として結晶させた本酵素結晶を、ショ糖約2Mを含む結晶化母液に置換したものおよび、グリセロール20%を含む母液に置換したものが-150度でも良好な回折を与えることが明らかになった。この両者の結晶の回折強度データを-150度で、高エネルギー物理学研究放射光実験施設のシンクロトロン放射光を用いて収集した。これらの回折強度データは現在処理中である。次に、反応中間体を極低温条件下でトラップするためにcaged-ATPとγ-Glu-Cysとの共結晶化を試み、これらを含んだ結晶を硫酸アンモニウムを沈殿剤として得た。また、基質結合を阻害しにくいPEGを沈殿剤としてcaged-ATPとγ-Glu-Cysとの共結晶化を試み、新たな結晶系の結晶を得た。これらの結晶の回折強度データを実験室レベルのX線発生装置を用いて収集し、構造の精密化を行なった。今後、光照射によってcaged-ATPを分解しATPを生成させる実験条件の検索を行ない、放射光でのマシンタイム配分時に反応中間体を極低温条件下でトラップした結晶の回折強度データを収集する予定である。

The crystal structure of E. coli is determined by the comparison between the natural enzyme and the biochemical enzyme, and the crystal structure of the enzyme is determined by the enzyme reaction. The structure of the matrix complex of the enzyme was determined in detail, and the method and condition of the reaction intermediate analysis were investigated. As a result, sulfuric acid was used to crystallize the enzyme, and the sugar was used to crystallize the enzyme. The crystallization mother liquor was replaced by the sulfuric acid. The sulfuric acid solution was replaced by the sulfuric acid solution. The reflection intensity of the crystal of the crystal is-150 degrees, and the high temperature is used for the study of radiation physics. The intensity of the bending is now being processed. Second, the reaction intermediate can be obtained by co-crystallization of caged-ATP and γ-Glu-Cys at very low temperatures. The co-crystallization of PEG, ATP and γ-Glu-Cys was studied and a new crystallization system was obtained. The reflection strength of these crystals is measured by the X-ray generator, and the structure is refined. In the future, the conditions for the decomposition of caged-ATP and the formation of ATP under irradiation, the separation of reaction intermediates under extremely low temperature conditions, and the predetermined strength of crystallization