哺乳類細胞における複製と連関して生じるDNA損傷とその修復反応系

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XRCC1タンパク質の二つのBRCTモチーフに着目して、これらの各々についての変異体タンパク質を発現する細胞株を樹立した。具体的には、部位特異的突然変異をPCRを用いた方法でXRCC1 cDNAのBRCT-aと-bに相当する部位に導入し、XRCC1タンパク質を発現していない変異細胞株EM9に導入して構成的に発現する株を複数単離した。これらの細胞株を用いてBRCT-a、-bの機能を調べたところ、大変興味深い結果が得られた。1)これまでXRCC1を発現しないEM9細胞がアルキル化剤に高感受性を示すのはXRCC1と結合するDNA ligase IIIが減少しているためだと考えられてきたが、実際はDNA ligase IIIが減少しているBRCT-bモチーフの変異株はアルキル化剤に抵抗性を示した。ところが、DNA ligase IIIが正常レベル存在し、修復も正常に行われているBRCT-aモチーフの変異体はアルキル化剤に高感受性を示した。このことはDNA修復そのもの以外の機構が細胞のアルキル化剤への感受性を決めていることを示唆している。また、このDNA修復以外の機構は、BRCT-aモチーフを介して働いていることが分かった。2)XRCC1タンパク質の細胞内でのリン酸化状態を調べたところ、複数のリン酸化を受けていることが分かった。さらに興味深いことに、このリン酸化の状態はアルキル化剤処理によって変化した。また、BRCT-aモチーフ変異株ではこのようなリン酸化の調節が失われていた。昨年度得られた結果とあわせて考えると、XRCC1タンパク質はBRCT-aモチーフを介してDNA修復後のDNA複製の再開に、BRCT-bモチーフを介して効率的なDNA修復に関与していると言える。このXRCC1の複製再開への関与はXRCC1タンパク質のリン酸化が関与している可能性が高い。今後はリン酸化を受けるアミノ酸残基の決定を行うとともに、リン酸化の有無と他のタンパク質との相互作用について解析を進める予定である。