肝特異的機能を有するヒト不死化肝細胞での人工肝の作製

利用具有肝脏特异性功能的人类永生化肝细胞创建人工肝脏

• 批准号: 11780624
• 负责人: 井上 裕介
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11780624/
• 关键词: ヒト不死化肝細胞; HNF4α

人工肝に最も適した細胞は正常ヒト肝細胞であるが、長期間、容易に継代培養することは現在のところ困難である。我々は、ヒト胎児肝細胞にSV40 LT抗原を導入することによりヒト不死化肝細胞(OUMS-29)を樹立した。OUMS-29細胞は無限増殖能を有し、無血清培地で培養可能である。さらには、アルブミン、トランスフェリンなどの肝特異的蛋白質の産生、NADPH-cytochrome c reductase、P450 1A1、1A2、2E1、3Aなどの薬物代謝酵素の発現誘導が認められる。本研究では、OUMS-29細胞を人工肝に応用するためにさらなる肝特異的機能の亢進を目指した。肝特異的遺伝子の発現には肝臓に豊富に存在する種々の転写因子群が関与していることが知られている。このため、ノザンブロットによりこれらの転写因子群の発現を調べたところ、OUMS-29細胞ではHNF4αの発現が著しく減少していることが認められた。そこで、RT-PCRにより全長のヒトHNF4α遺伝子をクローニングして発現ベクターを構築した。そしてOUMS-29細胞にヒトHNF4α発現ベクターを導入することにより、ヒトHNF4αタンパク質を安定に発現する細胞株(OUMS-29/HNF4α)をクローニングした。この細胞株は、核でHNF4αを顕著に発現しており、かつ野生型のHNF4αと同様のDNA結合活性を有していた。さらには肝特異的遺伝子である血液凝固X因子、アポリポタンパク質AI、CII、CIII、α1-アンチトリプシン、およびHNF1αなどの発現が認められるようになった。このことから、ヒトHNF4αを導入することによりOUMS-29細胞の肝特異的機能が亢進することが明らかになった。

Artificial liver に most も し た は normal cell ヒ ト hepatocellular で あ る が, long-term and easy に 継 generation develop す る こ と は now の と こ ろ difficult で あ る. I 々 は, ヒ ト tire where liver cell に SV40 LT antigen を import す る こ と に よ り ヒ ト die change hepatocytes (OUMS - 29) を set し た. The <s:1> unlimited proliferation potential を of UMS-29 cells is available for で and serum-free culture で is possible である. さ ら に は, ア ル ブ ミ ン, ト ラ ン ス フ ェ リ ン な ど の liver specific protein の produce, NADPH cytochrome c reductase, P450 1 a1, a2, 2 e1, 3 a な ど の 薬 content metabolic enzyme の 発 induced が now recognize め ら れ る. In this study, で を, umS-29 cells を, artificial liver に応, and するためにさらなる liver-specific hyperfunction を eye finger <s:1> た. Traces of liver specific 伝 son の 発 now に は routine liver に aboundant に exist す る kind 々 の planning factor group of が masato and し て い る こ と が know ら れ て い る. こ の た め, ノ ザ ン ブ ロ ッ ト に よ り こ れ ら の planning factor group of の 発 now を adjustable べ た と こ ろ, OUMS - 29 cell で は HNF4 alpha の 発 が now the し く reduce し て い る こ と が recognize め ら れ た. そ こ で, rt-pcr に よ り span の ヒ ト HNF4 alpha posthumous son 伝 を ク ロ ー ニ ン グ し て 発 now ベ ク タ ー を build し た. そ し て OUMS - 29 cell に ヒ ト HNF4 alpha 発 now ベ ク タ ー を import す る こ と に よ り, ヒ ト HNF4 alpha タ ン パ ク qualitative を settle に 発 now す る cell lines (OUMS - 29 / HNF4 alpha) を ク ロ ー ニ ン グ し た. こ の cell lines は, nuclear で HNF4 alpha を 顕 the に 発 now し て お り, か つ wild-type の HNF4 alpha と with others の DNA binding activity を have し て い た. さ ら に は liver specific heritage 伝 son で あ る blood coagulation factor X, ア ポ リ ポ タ ン パ ク qualitative AI, CII, CIII and alpha 1 - ア ン チ ト リ プ シ ン, お よ び HNF1 alpha な ど の 発 が now recognize め ら れ る よ う に な っ た. こ の こ と か ら, ヒ ト HNF4 alpha を import す る こ と に よ り OUMS が - 29 の liver cell specific function hyperfunction す る こ と が Ming ら か に な っ た.

项目成果

Kobayashi, N., Inoue, Y., et al.: "Transplantation of highly differentiated immortalized human hepatocytes to treat acute liver failure"Transplantation. 69(2). 202-207 (2000)

Kobayashi, N., Inoue, Y., et al.：“移植高度分化的永生化人肝细胞以治疗急性肝衰竭”移植。