肝特異的機能を有するヒト不死化肝細胞での人工肝の作製

利用具有肝脏特异性功能的人类永生化肝细胞创建人工肝脏

基本信息

批准号：
11780624
负责人：
井上裕介
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11780624/
关键词：
ヒト不死化肝細胞 HNF4α

项目摘要

人工肝に最も適した細胞は正常ヒト肝細胞であるが、長期間、容易に継代培養することは現在のところ困難である。我々は、ヒト胎児肝細胞にSV40 LT抗原を導入することによりヒト不死化肝細胞(OUMS-29)を樹立した。OUMS-29細胞は無限増殖能を有し、無血清培地で培養可能である。さらには、アルブミン、トランスフェリンなどの肝特異的蛋白質の産生、NADPH-cytochrome c reductase、P450 1A1、1A2、2E1、3Aなどの薬物代謝酵素の発現誘導が認められる。本研究では、OUMS-29細胞を人工肝に応用するためにさらなる肝特異的機能の亢進を目指した。肝特異的遺伝子の発現には肝臓に豊富に存在する種々の転写因子群が関与していることが知られている。このため、ノザンブロットによりこれらの転写因子群の発現を調べたところ、OUMS-29細胞ではHNF4αの発現が著しく減少していることが認められた。そこで、RT-PCRにより全長のヒトHNF4α遺伝子をクローニングして発現ベクターを構築した。そしてOUMS-29細胞にヒトHNF4α発現ベクターを導入することにより、ヒトHNF4αタンパク質を安定に発現する細胞株(OUMS-29/HNF4α)をクローニングした。この細胞株は、核でHNF4αを顕著に発現しており、かつ野生型のHNF4αと同様のDNA結合活性を有していた。さらには肝特異的遺伝子である血液凝固X因子、アポリポタンパク質AI、CII、CIII、α1-アンチトリプシン、およびHNF1αなどの発現が認められるようになった。このことから、ヒトHNF4αを導入することによりOUMS-29細胞の肝特異的機能が亢進することが明らかになった。

最适合人造肝脏的细胞是正常的人肝细胞，但是目前很难长期轻松地亚文化。我们通过将SV40 LT抗原引入人类胎儿肝细胞中，建立了永生的肝细胞（OUMS-29）。 OUMS-29细胞具有无限的生长潜力，可以在无血清培养基中培养。此外，观察到肝脏特异性蛋白（如白蛋白和转铁蛋白）的产生，以及诱导药物代谢酶的表达，例如NADPH-CYTOCHROME C还原和P450 1A1，1A2、2E1和3A的诱导。在这项研究中，我们旨在进一步增强肝脏特异性功能，以便将OUMS-29细胞应用于人造肝脏。众所周知，肝脏中丰富的各种转录因子涉及肝特异性基因的表达。因此，当通过北印迹检查这些转录因子的表达时，发现HNF4α的表达在OUMS-29细胞中显着降低。因此，通过RT-PCR克隆了全长的HNF4α基因以构建表达载体。然后，通过将人类HNF4α表达载体引入OUMS-29细胞中，将稳定表达人HNF4α蛋白（OUMS-29/HNF4α）的细胞系克隆。该细胞系在细胞核中显着表达HNF4α，并且与野生型HNF4α具有相似的DNA结合活性。此外，肝脏特异性基因的表达，例如血液凝结因子X，载脂蛋白AI，CII，CIII，α1-抗抗胰蛋白酶和HNF1α的表达已经显而易见。这表明人HNF4α的引入增强了OUMS-29细胞的肝特异性功能。