植物液胞タンパク質の細胞内輸送に関わる細胞質因子の解析

植物液泡蛋白细胞内运输涉及的细胞质因子分析

基本信息

批准号：
12740446
负责人：
嶋田知生
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

輸送レセプターPV72はタイプ1の膜タンパク質で,ルーメンドメインで液胞タンパク質と結合しその細胞内輸送を行っている.PV72のC末端37アミノ酸は細胞質側に出ており,他の因子と相互作用することにより,PV72の細胞内局在性や機能を制御していると考えられる.本研究では,PV72の細胞質ドメインに注目し,輸送を担う輸送装置の面から,液胞タンパク質の細胞内輸送の分子機構を解析した.輸送レセプターPV72のルーメンドメインをGFPに置換したコンストラクトをシロイヌナズナ培養細胞に一過的に発現させた.その結果,細胞質中にドット状の蛍光パターンが見られた.培養細胞の内在性のレセプターを蛍光抗体法で検出すると,GFP蛍光と一致したことから,本コンストラクトは正しい細胞内局在性を反映していると考えられた.一過的発現でドット状の蛍光パターンになった後に,細胞を薬剤ブレフェルジンAで処理すると,GFP蛍光はネットワーク状になった.さらに,GFP蛍光はRGP1タンパク質の蛍光抗体法によるパターンと一致した.これらの結果から,本レセプターはゴルジ体に局在していることが判明した.PV72の細胞質ドメインと相互作用する因子を探索するために,上記GFPコンストラクトのデリーションシリーズを作製し解析した.その結果,細胞質ドメインを削るとゴルジ体には留まれず,GFPが細胞膜まで運ばれることが判明した.C末端35アミノ酸まで削っても同様の結果であった.このことから,細胞質ドメインのN末付近の配列が何らかの因子と相互作用しゴルジ体局在化に必要でると考えられた.細胞質ドメインのチロシンモチーフのチロシンをアラニンに置換すると,液胞に到達しやすくなることが判明した.このことから,チロシンモチーフが細胞質因子と相互作用し,PV72のゴルジ体へのリサイクルに効いている可能性が考えられた.

转运受体PV72是一种1型膜蛋白，与管腔结构域中的液泡蛋白结合并细胞内传输。 PV72的37个氨基酸位于细胞质侧，被认为可以通过与其他因素相互作用来调节PV72的亚细胞定位和功能。在这项研究中，我们专注于PV72的细胞质结构域，并分析了液泡蛋白质内的细胞内转运的分子机制，从负责运输的转运装置的角度。传输受体 - 一种在拟南芥培养的细胞中瞬时表达PV72的管腔域的构建体。结果，在细胞质中发现了点状荧光图。当通过免疫荧光检测到培养细胞的内源性受体时，人们认为该构建体反映了正确的亚细胞定位。瞬时表达后，细胞变成了点状荧光模式，然后用药物Brefeldin A. GFP荧光处理成为网络。此外，GFP荧光与免疫荧光的RGP1蛋白的模式一致。这些结果表明，该受体位于高尔基体中。为了寻找与PV72的细胞质结构域相互作用的因素，我们创建并分析了一系列GFP构建体的缺失系列。结果，当去除细胞质结构域时，它没有保留在高尔基体中，而是将GFP携带到细胞膜上。去除C末端35氨基酸时，结果相似。这表明细胞质结构域N末端附近的序列与某个因素相互作用，这对于高尔基体定位是必不可少的。已经发现，用丙氨酸代替细胞质结构域中的酪氨酸基序，使其更容易到达液泡。这表明酪氨酸基序与细胞质因子相互作用，并有效地将PV72回收到高尔基体中。