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培養細胞を用いたホヤの金属輸送体の機能解析

使用培养细胞进行海鞘金属转运蛋白的功能分析

基本信息

批准号：
12740461
负责人：
宇山太郎
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12740461/
关键词：
バナジウム金属輸送体金属濃縮ホヤ脊索動物培養細胞

项目摘要

海水中からバナジウムイオンを高濃度かつ高選択的に濃縮するホヤは、金属イオンの濃縮機構を解析するための格好のモデル動物である。これまでに1)濃縮の担い手が約10種類の血球の中のバナジウム濃縮細胞(バナドサイト)であること。2)この細胞のもつ特異な能力は、細胞質に存在するバナジウム結合タンパク質、ペントースリン酸経路の酵素群、硫酸酸性の液胞膜上の液胞型H-ATPaseなどの素要素が効率よく連携することにより発揮されていることが判明している。バナドサイトにおけるバナジウムの濃縮機構を解明する上で、残された重要な素要素は、細胞内や液胞内へ直接バナジウムイオンを輸送する金属輸送体を明らかにすることである。本研究では、ホヤのバナドサイトにおいて細胞内や液胞内へ直接バナジウムイオンを輸送する金属輸送体を同定するため、既知の金属輸送体の中からバナドサイトに局在する金属輸送体を探索し、これを哺乳類細胞に発現させてバナジウム濃縮能をもつ培養細胞を作製することを計画した。本研究による成果は以下の通り。1.スジキレポヤの血球cDNAライブラリーから金属輸送体のNramp, metal-ATPaseを単離し、全長のcDNA配列を明らかにした。2.Nrampの細胞外の糖鎖修飾領域、細胞内の金属輸送に必須な領域をコードするcDNA領域を、マルトース結合タンパク質発現ベクターに導入し、融合タンパク質を合成した。3.ホヤのNrampのタンパク質コード領域を合成し、GFP発現ベクターに組み込んだ。4.上記のNramp-GFP融合タンパク質発現ベクターをCHO-K1細胞に導入し、培養細胞内でホヤのNrampを発現させた。5.ホヤのNrampを発現させたCHO-K1細胞をパナジウムを含む培地でインキュベートしたところ、コントロールの細胞の2〜4倍のバナジウムを取り込むことを見いだした。

The concentration of metals in seawater is high, and the concentration mechanism of metals in seawater is high. 1) Concentrated cells are concentrated among about 10 types of blood cells 2) The specific ability of these cells is determined by the existence of cytosol, enzyme group of acid pathway, efficiency of extracellular H-ATPase elements on the membrane of sulfuric acid, and the existence of cytosol. The concentration mechanism of the cell in the cell can be explained by the presence or absence of an important element, such as a metal transporter, which can be transported directly from the cell to the intracellular cell. This study is aimed at identifying metal transporters that can be transported directly into cells or cells. Among the known metal transporters, metal transporters can be found in mammalian cells, and concentrated energy can be produced in cultured cells. The results of this study are as follows. 1. The Nramp, metal-ATPase of the metal transporter from the blood cell cDNA of Sjeljiljil 2. Nramp's extracellular glyco-lock modification domain, intracellular metal transport domain, cDNA domain, fusion protein development domain, fusion protein synthesis domain 3. Nramp's quality control field is synthesized, GFP's quality control field is synthesized, and GFP's quality control field is synthesized. 4. The Nramp-GFP fusion protein described above was developed when introduced into CHO-K1 cells, and Nramp was developed in cultured cells. 5. The Nramp was developed by CHO-K1 cells, which were divided into 2~4 times as many cells as the original cell.