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抗スポロゾイト蛍光抗体法によるクリプトスポリジウムの生育活性の迅速評価法の開発

抗子孢子荧光抗体法快速评价隐孢子虫生长活性的方法的建立

基本信息

批准号：
12750501
负责人：
森田重光
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Azabu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

モノクローナル抗体の作製オーシスト破砕液またはスポロゾイトのホモジェネートで免疫したマウスから脾臓を摘出し,PEG法でハイブリドーマを作製した。スクリーニングELISAにはスポロゾイトのホモジェネート標品(SH)を吸着させたプレートとオーシスト壁標品(OW)を吸着させたプレートを用いた。その結果,スポロゾイト抗体の侯補として7クローンが選択された。これらのクローンからFITC標識抗体を作製し,脱嚢処理したクリプトスポリジウムの染色性を観察したところ,3抗体はスポロゾイトに対する特異性が高かったが,オーシスト壁も若干染色されてしまった。残り4抗体は特異性が認められなかった。脱嚢法の最適化タウロコール酸ナトリウムとトリプシン混合溶液(T液)およびデシキシコール酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウム混合溶液(D液)を用いてフローサイトメトリーに適する脱嚢法を検討した。その結果,D液は脱嚢したスポロゾイトの消失時間がT液に比べて短いが,フローサイトメーターで計測した場合のバックグラウンドが低かった。また,脱嚢したスポロゾイト数が最大になる培養時間は60分であった。この結果から,D液で60分間培養する脱嚢法が適していると判断した。測定条件の設定オーシストに紫外線を照射し,脱嚢率を50%にコントロールした試料と紫外線を照射しなかった試料(脱嚢率100%)を前述の脱嚢法で処理し,スポロゾイト抗体候補で染色してからフローサイトメーターで計測した。その結果,3抗体ともにポリクローナル抗体で染色した場合と差は認められず,スポロゾイトとオーシスト壁の染色性の差を弁別して検出することはできなかった。しかし,脱嚢後の「オーシスト壁」数に対する「スポロゾイト」数の比は理論比よりも10%程度低くなる傾向が認められたものの,前方散乱光と側方散乱光との座標領域の設定により弁別できることが明らかとなった。

モノクローナルAntibodies Manufactured The immune system is used to extract the spleen, and the PEG method is used to produce the immune system. ELISA ELISA standard product (SH) The させたプレートとオーシストwall standard product (OW) is the させたプレートを用いた.そのresults, スポロゾイトantibodiesの Houbuとして7クローンが选された.これらのクローンからFITC-labeled antibody is produced, and the deconjugation treatment is done by using a stainable FITC-labeled antibody.たところ,3 antibody はスポロゾイトに対するspecificity is high かったが, オーシストwall もseveral staining されてしまった. The specificity of the residual 4 antibodies is the same. Optimization of decondensation method: Tetrahydrofuran acid Tetrahydrofuran mixed solution (T solution) Tetrahydrofuran acid Tetrahydrofuran The ウムとhydrogen carbonate ナトリウム mixed solution (D solution) is suitable for the いてフローサイトメトリーにAdaptation of the する dehydration method を検した. As a result, the disappearance time of D liquid is shorter than that of D liquid. , フローサイトメーターで Measurement した Occasion のバックグラウンドが Low かった.また, take off the ぢしたスポロゾイトnumber がThe maximum になるcultivation time is 60 minutes であった. The result is the same, the D solution is cultured in 60 minutes, the decontamination method is suitable, and the judgment is made. The measurement conditions were set using ultraviolet irradiation and a decontamination rate of 50%, and the sample was irradiated with ultraviolet rays. (The decontamination rate is 100%) The above-mentioned decontamination method was used, and the deconjugation antibody candidate staining method was measured.そのResults, 3 Antibody ともにポリクローナル Antibody で Staining した Occasion と difference は cognition められず, スポロゾイトとオーシストwallのdyeabilityのdifferentを弁比して検出することはできなかった.しかし, after taking off the 嚢の「オーシストwall」number に対する「スポロゾイト」number の比は theory is 10% lower than よりもくなる lean Toward the direction of the light, scattered light to the side, scattered light to the side, and coordinate area setting.