植物ウイルス遺伝子特異的ジーンサイレンシングの分子細胞生物学的研究

宿主植物が感染ウイルスの増殖を特異的に抑制する相同性依存型ジーンサイレンシングという現象が数種の宿主とウイルスの組合せで近年報告され始めた.本現象を分子細胞生物学的に解析することをめざす本研究では、まず既存の感染性キュウリモザイクウイルス(Cucumber mosaic ; CMV)のRNA3にコードされる細胞間移行蛋白質遺伝子領域に関する合計7種類の非感染性欠失変異体を作出した.また,同じRNA3にコードされる外被蛋白質遺伝子領域に関する欠失変異体ならびにGFP融合細胞間移行タンパク質をコードするキメラCMV RNA3を構築した.さらに,これら欠失変異体の部を用いてウイルスRNAの複製過程で派生すると考えられるセンス,アンチセンスあるいは2本鎖RNAのin vitro転写合成を行った.一方,キュウリ,タバコ,ヒョウタン,ササゲならびにダイコンから相同性依存型ジーンサイレンシングへの関与が示唆されているRNA依存RNA合成酵素(RdRP)遺伝子のcDNAクローニングを試みた.その結果,キュウリ,タバコからほぼ完全長のクローンの取得に成功した.現在,各種CMV RNAおよびそれらの人工変異体を宿主表皮細胞へマイクロインジェクションし,各種遺伝子特異的非放射性プローブを用いたin situハイブリダイゼーション法の条至適条件の決定を行っており,RdRP遺伝子発現量の比較を含めたジーンサイレンシングシグナル伝達動態解析の実施段階に入っている.

宿主植物が感染ウイルスの増殖を特異的に抑制する相同性依存型ジーンサイレンシングという現象が数種の宿主とウイルスの組合せで近年報告され始めた.本現象を分子細胞生物学的に解析することをめざす本研究では、まず既存の感染性キュウリモザイクウイルス(Cucumber mosaic ; CMV)のRNA3にコードされる細胞間移行蛋白質遺伝子領域に関する合計7種類の非感染性欠失変異体を作出した.また,同じRNA3にコードされる外被蛋白質遺伝子領域に関する欠失変異体ならびにGFP融合細胞間移行タンパク質をコードするキメラCMV RNA3を構築した.さらに,これら欠失変異体の部を用いてウイルスRNAの複製過程で派生すると考えられるセンス,アンチセンスあるいは2本鎖RNAのin vitro転写合成を行った.一方,キュウリ,タバコ,ヒョウタン,ササゲならびにダイコンから相同性依存型ジーンサイレンシングへの関与が示唆されているRNA依存RNA合成酵素(RdRP)遺伝子のcDNAクローニングを試みた.その結果,キュウリ,タバコからほぼ完全長のクローンの取得に成功した.現在,各種CMV RNAおよびそれらの人工変異体を宿主表皮細胞へマイクロインジェクションし,各種遺伝子特異的非放射性プローブを用いたin situハイブリダイゼーション法の条至適条件の決定を行っており,RdRP遺伝子発現量の比較を含めたジーンサイレンシングシグナル伝達動態解析の実施段階に入っている.