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ピロロキノリンキノン依存性メタノール脱水素酵素の活性発現に必要な遺伝子群解析

吡咯喹啉醌依赖性甲醇脱氢酶活性表达所需基因的分析

基本信息

批准号：
12760058
负责人：
外山博英
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Yamaguchi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

Methylobacterium extorquens AM1はメタノールを唯一の炭素源として生育する際、キノプロテインメタノール脱水素酵素(MDH)を発現し酸化を行なう。MDHの活性発現には30以上の遺伝子が必要とされ、ゲノム中でいくつかのクラスターを形成している。その中で最も大きなクラスターがmxaFJGIR(S)ACKLDEHB遺伝子群で、いくつかの遺伝子は機能が未解明である。そのひとつであるmxaD遺伝子について解析した。mxaDが欠損すると、粗酵素抽出液中のMDH活性は野生株以上に強いにもかかわらず、生菌体のメタノール酸化活性は著しく減少した。変異株からMDHとその電子受容体であるチトクロムc_Lを精製し、酵素化学的性質等について検討した。変異株からの精製MDHは吸収スペクトルが野生型と異なり、360nm付近の吸収が減少していた。電子共鳴スピンでは野生型と同じ波形を示したが、シグナル強度は野生型の約9倍であった。補欠分子族であるピロロキノリンキノンが、野生型では10%程度がセミキノン型で、変異株からのMDHではほぼ100%であると推定された。精製チトクロムc_Lの酸化還元電位は、野生型、変異株からのものどちらも約250mVであった。人工電子受容体であるフェナジンメトサルフェートを使った場合にはどちらの精製MDHでも活性に違いはなかったが、チトクロムc_Lを使い活性測定すると、変異株からの酵素は野生型に比べ著しく活性が低かった。MxaDはペリプラズム移行シグナルを有していることから、ペリプラズムでのMDH成熟過程に働くシャペロンか、メタノール酸化呼吸鎖の構成成分そのものであると考えられた。従来考えられていた呼吸鎖構成成分は4つであったが、再構成実験での活性は非常に低く、生体中での活性を十分には説明できていなかったので、見過ごされていた成分が発見されたと考えられる。

Methylobacterium extracvens AM1 is the only carbon source that can be used to produce and acidify the enzyme MDH. The activity of MDH is more than 30 times higher than that of other enzymes. In the middle of the game, the most important thing is to use the mxaFJGIR(S)ACKLDEHB genetic subgroup, the middle part of the genetic function is not explained.そのひとつであるmxaD遗伝子について解析した。MDH activity in crude enzyme extract was higher than that in wild strain, while the activity of MXD in crude enzyme extract was lower than that in wild strain. The electron acceptor of different strains is refined, and the chemical properties of enzymes are discussed. The absorption of purified MDH at 360nm is reduced. The electron resonance is about 9 times stronger than that of the wild type. Complementary molecular families are estimated to be 10% different from wild-type and 100% different from MDH. The acidification reduction potential of purified, wild type and mutant plants is about 250mV. The activity of the purified MDH in the artificial electronic receptor was lower than that in the wild type. MxaD is a selection of the components of the acidified respiratory lock during MDH maturation. The composition of the respiratory lock is very low, and the activity in the organism is very low. The composition of the respiratory lock is very low.