Ca^<2+>波・Ca^<2+>オシレーションにおける小胞体内Ca^<2+>動態の画像解析

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平成13年度では、小胞体への移行配列を有するCAMELEONをマウス卵に発現させることを試みた。無細胞的にポリAを付加したCAMELEONのRNAを合成し、マウスGV卵に注入した後卵を培養して成熟させた。CAMELEONは発現し卵は蛍光を発するようになったが、発現したCAMELEONは小胞体に移行せず、その存在は小胞体に限局しなかった。同じ移行配列を有するYellow Fluorescent Protein(YFP)を発現させた卵ではYFPは小胞体に移行して小胞体に局在したことから、卵で発現したCAMELEONを小胞体へ局在させるには特別な工夫が必要であると考えられ、その努力を継続中である。マウス卵で発現したCAMELEONの蛍光は十分に明るく、CAMELEONを小胞体へ移行させることさえできれば小胞体内Ca^<2+>濃度の測定は可能であると考えられる。ポリAを付加したmRNAを合成しGV卵に注入する手法を用いて、CAMELEON以外に多くの外来タンパク質をマウス卵に効率的に発現させることができた。精子と卵の融合に関与する膜タンパクであるCD9をノックアウトマウス卵に発現させることにより、融合阻害を回復させることができた。また、CD9とGFPとの融合タンパク質を発現させることにより、受精時のCD9の動態を可視化することができた。さらに予備的な実験ながら、ミトコンドリア移行配列を有するpHプローブタンパク質およびCa^<2+>プローブタンパク質を発現させて、ミトコンドリアのpHとCa^<2+>濃度の動態をモニターすることができた。マウス未受精卵のミトコンドリア内pHは培養細胞のそれと比較して低く、未受精卵でのATP産生が活発でないことが示唆された。また、ミトコンドリア内Ca^<2+>濃度は細胞質Ca^<2+>濃度を反映せず、従来の報告が測定上のアーティファクトである可能性が高いことが示唆された。