タンパク質複合体の動きをリアルタイムで追跡するGFPトラッキング法の確立

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本研究課題では、クライオ電子顕微鏡解析で得られた精密構造情報と高速原子間力顕微鏡（HS-AFM）解析で得られる動的構造情報を組み合わせて、タンパク質複合体のサブユニットレベルでのダイナミクスを容易に解析できる「GFPトラッキング法」の確立を試みた。まず、６つの膜貫通サブユニットで構成される膜タンパク質複合体であるTOM複合体に焦点を当てて研究を進めた。TOM複合体のクライオ電顕構造に基づいてGFPタグを導入するサブユニットを３つ選定し、GFPタグが溶媒側に露出するように導入位置を決定した。TOM複合体の全てのサブユニットを発現させるためのカセットベクターは既に構築済みであり、本研究ではカセットベクターの任意の位置にGFPタグを導入し、出芽酵母のゲノムに発現カセットを組み込むことで、GFP導入変異体発現株を樹立した。これらの発現株を用いてGFP導入変異体の発現スクリーニングを行ったところ、３サブユニット中２つにおいてGFPが融合したサブユニットの発現を確認し、蛍光顕微鏡観察ではGFP蛍光シグナルを捉えることにも成功した。しかし、精製TOM複合体の分子量や構成サブユニットについて、ゲルろ過クロマトグラフィーやBlue Native-PAGEを用いて評価したところ、GFPタグがTOM複合体の中に効率的に組み込まれていない可能性が考えられた。Tom22サブユニットの可溶性領域にGFPタグが導入された変異体についてはHS-AFM解析まで進めることができたが、GFPと考えられる優位なシグナルを得るには至っていない。今後は、GFPの導入位置を再検討するとともに、より小さなエピトープタグを導入した変異体の準備も並行して進めていく。