DNAメチル化による遺伝子発現不活化を回避するレトロウイルスベクターの開発

レトロウイルスベクターの生体内でのプロモーター不活性化機構の解析と、その回避の道を探る目的で、GFPを発現するMoMLV由来のレトロベクターを組み込んだマウスリンパ腫細胞株EL4を同系マウス腹腔内に移植し、GFPの発現を指標に遺伝子発現を解析する系を確立した。GFP発現細胞をあらかじめ皮下に投与したマウスでは、より速やかに腹腔内投与EL4におけるGFPの発現低下が見られたことから、発現抑制に宿主免疫が関与することが示唆された。また、同EL4細胞をin vitroに取り出して培養しても発現は変化せず、ゲノムレベルでの不可逆的な抑制であると考えられた。一方、ベクターのLTR U3領域をHTLV-1 U3に置き換え、GFP融合Tax遺伝子(Gax)をコードするレトロウイルスベクターを作成し同実験を行ったところ、腹腔内ではGaxの発現が強く抑制されたが短時間のin vitroでの培養で抑制が解除された。そこで、in vivo、in vitroにおける転写量をリアルタイムRT-PCR法で定量したところ、24時間の培養での転写の活性化が確認された。次に、この可逆的転写抑制におけるプロモーターCpGメチル化の関与を検討するため、プロウイルスゲノムU3領域DNAをbi-sufite sequencing法で解析したところ、抑制状態では11箇所のCpG塩基配列のうち9箇所が約60%メチル化を受けていたが、24時間培養後には、8箇所のCpG塩基配列について約30%程度までメチル化頻度が減少していることが示され、HTLV-1 U3の転写抑制にはCpGメチル化が関与しているが、生体外で培養することで短時間に脱メチル化されることが明らかとなった。

レトロウイルスベクターの生体内でのプロモーター不活性化機構の解析と、その回避の道を探る目的で、GFPを発現するMoMLV由来のレトロベクターを組み込んだマウスリンパ腫細胞株EL4を同系マウス腹腔内に移植し、GFPの発現を指標に遺伝子発現を解析する系を確立した。GFP発現細胞をあらかじめ皮下に投与したマウスでは、より速やかに腹腔内投与EL4におけるGFPの発現低下が見られたことから、発現抑制に宿主免疫が関与することが示唆された。また、同EL4細胞をin vitroに取り出して培養しても発現は変化せず、ゲノムレベルでの不可逆的な抑制であると考えられた。一方、ベクターのLTR U3領域をHTLV-1 U3に置き換え、GFP融合Tax遺伝子(Gax)をコードするレトロウイルスベクターを作成し同実験を行ったところ、腹腔内ではGaxの発現が強く抑制されたが短時間のin vitroでの培養で抑制が解除された。そこで、in vivo、in vitroにおける転写量をリアルタイムRT-PCR法で定量したところ、24時間の培養での転写の活性化が確認された。次に、この可逆的転写抑制におけるプロモーターCpGメチル化の関与を検討するため、プロウイルスゲノムU3領域DNAをbi-sufite sequencing法で解析したところ、抑制状態では11箇所のCpG塩基配列のうち9箇所が約60%メチル化を受けていたが、24時間培養後には、8箇所のCpG塩基配列について約30%程度までメチル化頻度が減少していることが示され、HTLV-1 U3の転写抑制にはCpGメチル化が関与しているが、生体外で培養することで短時間に脱メチル化されることが明らかとなった。