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DNAメチル化による遺伝子発現不活化を回避するレトロウイルスベクターの開発

开发逆转录病毒载体，避免由于 DNA 甲基化导致基因表达失活

基本信息

批准号：
12770160
负责人：
古田里佳
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kansai Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

レトロウイルスベクターの生体内でのプロモーター不活性化機構の解析と、その回避の道を探る目的で、GFPを発現するMoMLV由来のレトロベクターを組み込んだマウスリンパ腫細胞株EL4を同系マウス腹腔内に移植し、GFPの発現を指標に遺伝子発現を解析する系を確立した。GFP発現細胞をあらかじめ皮下に投与したマウスでは、より速やかに腹腔内投与EL4におけるGFPの発現低下が見られたことから、発現抑制に宿主免疫が関与することが示唆された。また、同EL4細胞をin vitroに取り出して培養しても発現は変化せず、ゲノムレベルでの不可逆的な抑制であると考えられた。一方、ベクターのLTR U3領域をHTLV-1 U3に置き換え、GFP融合Tax遺伝子(Gax)をコードするレトロウイルスベクターを作成し同実験を行ったところ、腹腔内ではGaxの発現が強く抑制されたが短時間のin vitroでの培養で抑制が解除された。そこで、in vivo、in vitroにおける転写量をリアルタイムRT-PCR法で定量したところ、24時間の培養での転写の活性化が確認された。次に、この可逆的転写抑制におけるプロモーターCpGメチル化の関与を検討するため、プロウイルスゲノムU3領域DNAをbi-sufite sequencing法で解析したところ、抑制状態では11箇所のCpG塩基配列のうち9箇所が約60%メチル化を受けていたが、24時間培養後には、8箇所のCpG塩基配列について約30%程度までメチル化頻度が減少していることが示され、HTLV-1 U3の転写抑制にはCpGメチル化が関与しているが、生体外で培養することで短時間に脱メチル化されることが明らかとなった。

To establish a system for the analysis of inactivation mechanisms in vivo and for the detection of avoidance pathways, the origin of GFP production, the organization of GFP production, and the analysis of protein production in the abdominal cavity of a homologous cell line EL4. GFP expression decreased after subcutaneous injection and intraperitoneal injection of EL4. The same EL4 cells were cultured in vitro and showed irreversible inhibition. On the one hand, the LTR U3 domain of HTLV-1 U3 is replaced by GFP fusion tax gene (Gax), and the production of Gax in the abdominal cavity is strongly inhibited, and the inhibition is released for a short time in vitro culture. In vivo, in vitro and in vitro, the amount of DNA was quantified by RT-PCR, and the activity of DNA was confirmed by 24-hour incubation. In addition, the reversible CpG binding inhibition was analyzed by bi-suite sequencing method in U3 domain DNA, and the inhibition state was 11 CpG binding sites, 9 CpG binding sites, and 60% CpG binding sites. 8 CpG groups were arranged in about 30% of the total, and the frequency of CpG group formation decreased. HTLV-1 U3 was inhibited by CpG group formation. In vitro culture, CpG group formation was inhibited in a short time.