海洋性鉄酸化細菌の鉄酸化機構の遺伝的解析に関する基礎研究

本研究は、鉄酸化細菌の鉄酸化機構を遺伝子レベルで解析することを目的としており、トランスポゾンの導入によって、鉄酸化活性に変異を有しているが、硫黄酸化活性は正常に機能する変異株を取得し、トランスポゾン導入部位の遺伝子解析によって鉄酸化に関与する遺伝子を同定しようというものである。エレクトロポレーションにより広宿主域プラスミドpLOFKmgfp(mini-Tn 10-kan-gfp)を導入して、カナマイシン耐性を獲得した菌株の分離を行った。トランスポゾン導入の有無をPCR法によって検討した結果、残念ながらいずれの株もその導入は確認できなかった。そこで、本年度は新たにトランスポゾームEZ::TN<KAN-2>(トランスポゾンTn5を含む、EPICENTRE社の製品)を、鉄酸化細菌に導入する方法の検討を行った。本実験では、既に遺伝子の解析が終了しているATCC23270株をトランスポゾーム導入株として用いた。トランスポゾーム複合体は、酵素であり、通常は中性付近で反応させる。鉄菌は、中性付近でコンピテントセルを作製すると、コロニー形成率が低くなるため、トランスポゾームの酵素活性が発揮されかつ、コンピテントセルがコロニーを形成するpH条件等の検討を行った。マグネシウムイオンを含まないpH5.5のバッファーでエレクトコンピテントセルを作製することによって、比較的コロニーの形成率が高いことが明らかとなり、このコンピテントセルを用いてトランスポゾームのエレクトポーレーションを行った。カナマイシン耐性を指標に硫黄培地で増殖できる形質転換体の選別を行った後、鉄培地で増殖できない株の選別を進めている。本研究は本年度が最終年度であるが、本研究は鉄酸化細菌の遺伝子解析に極めて重要であると考えているので、引き続き研究を継続していく予定である。

本研究は、鉄酸化細菌の鉄酸化機構を遺伝子レベルで解析することを目的としており、トランスポゾンの導入によって、鉄酸化活性に変異を有しているが、硫黄酸化活性は正常に機能する変異株を取得し、トランスポゾン導入部位の遺伝子解析によって鉄酸化に関与する遺伝子を同定しようというものである。エレクトロポレーションにより広宿主域プラスミドpLOFKmgfp(mini-Tn 10-kan-gfp)を導入して、カナマイシン耐性を獲得した菌株の分離を行った。トランスポゾン導入の有無をPCR法によって検討した結果、残念ながらいずれの株もその導入は確認できなかった。そこで、本年度は新たにトランスポゾームEZ::TN<KAN-2>(トランスポゾンTn5を含む、EPICENTRE社の製品)を、鉄酸化細菌に導入する方法の検討を行った。本実験では、既に遺伝子の解析が終了しているATCC23270株をトランスポゾーム導入株として用いた。トランスポゾーム複合体は、酵素であり、通常は中性付近で反応させる。鉄菌は、中性付近でコンピテントセルを作製すると、コロニー形成率が低くなるため、トランスポゾームの酵素活性が発揮されかつ、コンピテントセルがコロニーを形成するpH条件等の検討を行った。マグネシウムイオンを含まないpH5.5のバッファーでエレクトコンピテントセルを作製することによって、比較的コロニーの形成率が高いことが明らかとなり、このコンピテントセルを用いてトランスポゾームのエレクトポーレーションを行った。カナマイシン耐性を指標に硫黄培地で増殖できる形質転換体の選別を行った後、鉄培地で増殖できない株の選別を進めている。本研究は本年度が最終年度であるが、本研究は鉄酸化細菌の遺伝子解析に極めて重要であると考えているので、引き続き研究を継続していく予定である。