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哺乳類卵子での遺伝子発現系の開発と応用

哺乳动物卵基因表达系统的开发及应用

基本信息

批准号：
13877007
负责人：
宮崎俊一
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tokyo Women's Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

受精・発生初期段階での情報伝達機構解明の技術基盤確立のため、現在困難である、哺乳類未受精卵での機能蛋白発現系の確立をめざし、哺乳類未受精卵に注入、成熟過程において発現観察可能なmRNAの作成法の改良並びに応用を行った。昨年度は、比較的高感度に発現の検出が可能と考えられる、Green Fluorescent Protein(GFP)遺伝子の蛋白発現つまりは蛍光の検出を指標に、受精卵でのmRNAからの発現条件を決定した。具体的にはcappingしたRNA3'端に何も付加してない場合はその注入のみでは、発現の検出は困難であり、3'端にpoly A polymeraseによるpoly A付加反応を行い、200残基以上のpoly Aが付加されている場合、成熟卵でGFPの発現が検出可能であった。poly A polymeraseを使用する方法では、操作が煩雑であり、転写反応で直接poly Aを付加できるvectorの作成を目指し、標的タンパク3'端にpoly A構造を持つvectorの構築を試みた。50mer以上のpoly Aをもつlinkerを作成し、ligation反応によりBlue Script II SK(+)への組込みを行った。この場合、75merまでのpoly Aをもつvectorの構築には成功したが、100merを越えると、通常使用している大腸菌では構造が保てなくなり、poly Aの長さは80前後に制限されてしまった。このため、構造を保ちやすい、大腸菌のstrainを選択して試みたが、100残基前後で構造が保てなくなり、このvectorより作成した、poly Aを含むmRNAでは蛋白発現を確認するのが困難であった。このため、卵細胞特異的に発現しているmRNAの3'端構造に着目し、未成熟卵でのin vivo付加反応が行われることが期待できる、in vitroでのpoly A付加反応を必要としないvector系の構築を行っている。本研究では未成熟哺乳類卵で、卵成熟・受精能に影響なく蛋白を発現しうる実験系の一部は確立ができた。現在、GFPを利用した各種プローブ並びに受精関連因子を卵細胞に導入し受精に関わる細胞内情報伝達系ならびに受精関連因子の機能解析を継続して行っている。

The establishment of a technical base for understanding the information transmission mechanism at the early stages of fertilization and development, the current difficulties, the establishment of functional protein development systems for mammalian unfertilized eggs, the development of mammalian unfertilized eggs during injection and maturation, and the improvement and application of possible mRNA production methods. In the past year, the possibility of detection of high sensitivity was compared with that of Green Fluorescent Protein(GFP) protein detection index, and the conditions for detection of mRNA in fertilized eggs were determined. Specific capping-to-RNA3'end addition, in some cases, injection, detection, detection, 3' end poly A polymerase, poly A with more than 200 residues, detection of mature eggs GFP is possible. The method of using poly A polymerase is to construct vector directly by adding poly A to the vector. More than 50mer poly A links are created, ligated, and grouped into Blue Script II SK(+). In this case, the construction of 75mer poly A vector was successful, 100mer poly A vector was successful, and Escherichia coli was usually used. The construction of poly A vector was limited before and after 80. It is difficult to identify the expression of protein in E. coli strain, construct, vector and polyA mRNA before and after 100 residues. The 3'-terminal structure of mRNA in immature eggs is necessary for the construction of vector system. In this study, immature mammalian eggs, egg maturity and fertilization can affect the development of protein, and part of the system can be established. Now, GFP can be used to analyze the functions of various fertilization related factors and intracellular information related to oocyte introduction and fertilization.