肺動脈および気道平滑筋細胞における転写調節因子E2F-5の標的遺伝子解析

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(1)野生型のE2F-5、(2)pRb,p107,p130などpocket proteinとの結合部位および転写促進に作用する部位を欠失しているが、標的となるDNA配列には結合するため、正常のE2F-5の機能を阻害する、ドミナントネガティブ型のE2F-5、の遺伝子を発現するアデノウイルスベクターを構築している。野生型およびドミナントネガティブ型としてアミノ酸1-250番と57-250番の2種類を含む合計3種のプラスミドは米国ボストン大学のJ.Xiao博士から入手した。これらからcDNA部分を切り出してまずトランスファーベクター(pAdTrack-CMV,米国ジョンスホプキンス大学Vogelstein博士より供与)に組み込んだ。さらに大腸菌内でアデノウイルスのバックボーンプラスミド(pAdEasy,同上)と相同組換えを起こさせることによって目的のcDNAを発現するアデノウイルスベクターを作成した。これをGraham293細胞に移入したが、組換えアデノウイルスは得られず、上記遺伝子の発現が細胞にとって致死的であるものと考えられた。したがって、組換えアデノウイルスの作成の過程では組換え遺伝子の発現がブロックされ、ブロックを解除する蛋白を発現するアデノウイルスを目的の細胞に同時に感染させることによって目的の効果を得るシステムに変更することとし、現在作成中である。in vitroで気管平滑筋細胞を脱分化させる実験では、matrix gla protein,gelatinase Aなどの遺伝子の発現に変化が見られた。これら遺伝子の転写調節領域にE2F-5が結合する可能性について検討中である。