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細胞の膜系構築機構の解明のための試験管内膜合成反応系の創成

建立体外膜合成反应体系，阐明细胞膜系统构建机制

基本信息

批准号：
15658031
负责人：
太田明徳
金额：
$ 2.18万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

生体膜脂質の最も基本的なものはグリセロリン脂質である。本研究では、酵母由来のリン脂質合成系酵素と細胞成分を用いて、真核生物の代表的グリセロリン脂質であるホスファチジルコリン(PC)とホスファチジルエタノールアミン(PE)を含む二重層膜の、前駆体からのin vitro合成系の作製を試みた。エタノールアミン(Etn)からPEを合成するKennedy経路中でCDP-Etnの合成を触媒するCTP : phosphoethanolamine cytidylyltransferase(ECT)は経路の特異性と速度を決定する重要な酵素である。ECTをコードする遺伝子ECT1を操作して6xHis tagを付加した酵素を大腸菌中で生産し、これを精製して結晶化に成功した。放射光を利用する回折像から、その3次元構造を得た。また、アミノ酸置換変異を有するECTを複数種つくり、その酵素機能を解析中である。CDP-EtnからPEを合成する段階の遺伝子EPT1をクローン化し、酵素生産系を作成中である。酢酸生産菌Acetobacter acetiはPEのアミノ基をメチル化してPCを合成する。これは可溶性酵素であり、酵母の2種のPE methyltransferaseが膜結合酵素であってそれぞれ単独ではPCまでの3段階の反応を全て触媒する力が弱いのに比べ、単一の酵素で、PCまで合成可能である。そこで、この細菌の酵素遺伝子をクローン化し、glutathione S-transferase遺伝子を付加した融合遺伝子を作製して大腸菌中で生産、glutathione-Sepharoseカラムによって活性ある融合タンパク質を精製した。現在PEを含むリポソームにこの酵素を作用させ、PEからPCへのリン脂質極性基の変換を試みている。以上、補欠採択ということもあって時間が足りず、当初目的が達成されたわけではないが、目的とする膜の合成に必要ないくつかの酵素を調製中であり、計画は進行中である。

The most basic lipid of the somatic membrane In this study, we investigated the enzyme and cellular components of yeast derived lipid synthesis system, and the production of lipid synthesis system including double layer membrane and precursor from eukaryotic representative lipid synthesis system. CTP : phosphoethanolamine cytidyltransferase (ECT) is an important enzyme that determines the specificity and speed of the pathway in the synthesis of CDP-Etn in Kennedy pathway. ECT1 was successfully purified and crystallized by adding its 6xHis tag to E. coli. Radiated light is used to reflect light and three-dimensional structures. There are several kinds of enzyme function analysis methods. CDP-Etn is the first step in the synthesis of PE and the second step in the production of enzyme. Acetobacter aceti is a bacterium that produces acetic acid. The two PE methyltransferases of soluble enzymes and yeast are membrane bound enzymes. The enzyme activity of PC and its 3-stage reaction is weak compared with that of PC and its synthesis is possible. The enzyme gene of bacteria is transformed into glutathione S-transferase gene. The fusion gene is produced in Escherichia coli. The activity of glutathione-Sepharose gene is refined. Now PE contains the enzyme function of the complex group, PE contains the lipid polarity group of the complex group. The above, the lack of time, the original goal, the goal, the synthesis of the membrane, the necessary enzyme modulation, the project is in progress