網膜ペリサイト分泌血管内皮細胞増殖抑制因子の同定

视网膜周细胞分泌的血管内皮细胞增殖抑制剂的鉴定

基本信息

批准号：
15659034
负责人：
細谷健一
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Toyama Medical and Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

網膜ペリサイトから分泌される因子が網膜毛細血管内皮細胞の増殖を制御しているという仮説から、網膜毛細血管内皮細胞株と網膜ペリサイト株の共培養解析を行った結果、網膜ペリサイト株培養後の培地の濃縮液を網膜毛細血管内皮細胞株に添加すると内皮細胞増殖を著しく抑制することを見いだした。本研究は、網膜ペリサイト細胞株が分泌する網膜毛細血管内皮細胞増殖抑制因子を同定することを目的とした。網膜ペリサイト株培養後の培地の濃縮液からタンパクを回収し、分子量で分画し、網膜毛細血管内皮細胞株の増殖を抑制するフラクションから2次元電気泳動でタンパクを分離した。分離したタンパクをMALDI-TOFMSで分析し、タンパクを同定した。同定したタンパクはtoropomyosin (TM)と高い相同性を示した。Rat TM3を特異的に認識するプライマーを作製してRT-PCR法でオープンリーディングフレームのクローニングを行った。さらに、RT-PCR解析からラット網膜、網膜ペリサイト株に発現が示された。増幅された網膜毛細血管周皮細胞株のPCR産物をDNAシークエンサー解析した結果、rat TM3、rat TM6と異なる配列を示した。得られた遺伝子配列をpGEX-6P-1 vectorに導入し、大腸菌を用いて大量培養した。大腸菌からタンパクを精製し、リコンビナントタンパクを作製した。リコンビナントタンパクはMALDI-TOFMSによってタンパク質量を測定し、さらにprotein sequencerを用いてN末端アミノ酸配列の解析を行い、同定したタンパクであることを確認した。網膜毛細血管内皮細胞株の増殖に対し、同定したタンパクは1μM以上の添加で顕著な細胞増殖抑制効果を示した。以上の結果から、網膜ペリサイトはTMと高い相同性を示すタンパクを分泌していること、およびこのタンパクは網膜毛細血管内皮細胞の増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。

基于以下假设：视网膜周细胞分泌的因素控制着视网膜毛细管内皮细胞的增殖，我们对视网膜毛细血管内皮细胞系和视网膜周围周围菌株进行了共培养分析，并发现在培养的视网膜繁殖力菌株中添加了在视网膜毛细管抑制式培养基层均具有明显抑制的培养基培养基溶液中。这项研究旨在确定抑制视网膜周围细胞系分泌的视网膜毛细血管内皮细胞生长的因素。在视网膜白云母菌株的培养后，从培养基浓缩物中收集蛋白质，通过分子量分离，蛋白质通过二维电泳与抑制视网膜毛细血管内皮细胞系的生长的分数分离。通过MALDI-TOFMS分析分离的蛋白质以鉴定蛋白质。鉴定出的蛋白质与摩托肌球蛋白（TM）的同源性很高。准备了专门识别大鼠TM3的引物，并通过RT-PCR克隆开放式读取框。此外，RT-PCR分析显示在大鼠视网膜和视网膜周细胞菌株中的表达。放大视网膜毛细血管周细胞系的PCR产物的DNA测序仪分析与RAT™3和RAT™6的序列不同。将所得的基因序列引入PGEX-6P-1载体中，并使用大肠杆菌大量培养。从大肠杆菌中纯化蛋白质以产生重组蛋白。通过MALDI-TOFMS测量重组蛋白的蛋白质含量，并使用蛋白序列仪进一步分析N末端氨基酸序列，以确认它是已鉴定的蛋白质。当添加到1μm或更多时，鉴定出的蛋白质表现出细胞生长对视网膜毛细血管内皮细胞系生长的显着抑制作用。以上结果表明，视网膜周细胞分泌与TM表现高同源性的蛋白质，并且该蛋白表现出抑制视网膜毛细血管内皮细胞生长的作用。