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網膜ペリサイト分泌血管内皮細胞増殖抑制因子の同定

视网膜周细胞分泌的血管内皮细胞增殖抑制剂的鉴定

基本信息

批准号：
15659034
负责人：
細谷健一
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Toyama Medical and Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

網膜ペリサイトから分泌される因子が網膜毛細血管内皮細胞の増殖を制御しているという仮説から、網膜毛細血管内皮細胞株と網膜ペリサイト株の共培養解析を行った結果、網膜ペリサイト株培養後の培地の濃縮液を網膜毛細血管内皮細胞株に添加すると内皮細胞増殖を著しく抑制することを見いだした。本研究は、網膜ペリサイト細胞株が分泌する網膜毛細血管内皮細胞増殖抑制因子を同定することを目的とした。網膜ペリサイト株培養後の培地の濃縮液からタンパクを回収し、分子量で分画し、網膜毛細血管内皮細胞株の増殖を抑制するフラクションから2次元電気泳動でタンパクを分離した。分離したタンパクをMALDI-TOFMSで分析し、タンパクを同定した。同定したタンパクはtoropomyosin (TM)と高い相同性を示した。Rat TM3を特異的に認識するプライマーを作製してRT-PCR法でオープンリーディングフレームのクローニングを行った。さらに、RT-PCR解析からラット網膜、網膜ペリサイト株に発現が示された。増幅された網膜毛細血管周皮細胞株のPCR産物をDNAシークエンサー解析した結果、rat TM3、rat TM6と異なる配列を示した。得られた遺伝子配列をpGEX-6P-1 vectorに導入し、大腸菌を用いて大量培養した。大腸菌からタンパクを精製し、リコンビナントタンパクを作製した。リコンビナントタンパクはMALDI-TOFMSによってタンパク質量を測定し、さらにprotein sequencerを用いてN末端アミノ酸配列の解析を行い、同定したタンパクであることを確認した。網膜毛細血管内皮細胞株の増殖に対し、同定したタンパクは1μM以上の添加で顕著な細胞増殖抑制効果を示した。以上の結果から、網膜ペリサイトはTMと高い相同性を示すタンパクを分泌していること、およびこのタンパクは網膜毛細血管内皮細胞の増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。

Retinal capillary endothelial cell proliferation inhibition by factors secreted by retinal capillary endothelial cell line and retinal capillary endothelial cell line co-culture analysis results. Retinal capillary endothelial cell line proliferation inhibition by culture of retinal capillary endothelial cell line with concentrated solution. The aim of this study was to identify the inhibitory factors of retinal capillary endothelial cell proliferation secreted by retinal endothelial cell lines. The concentration of culture medium after culture of retinal capillary endothelial cell line was determined by molecular weight analysis, inhibition of proliferation of retinal capillary endothelial cell line, and isolation of two-dimensional electrokinetic analysis. MALDI-TOFMS analysis and identification The same is true for toropomyosin (TM). Rat TM3 is a special recognition tool for RT-PCR In addition, RT-PCR analysis showed that there was no difference between the two groups. The PCR products of retinal capillary pericytes were analyzed and the results showed that rat TM 3 and rat TM 6 were different. The pGEX-6P-1 vector was introduced into E. coli and cultured in large quantities. Coliform bacteria are purified and controlled. The MALDI-TOFMS was used to determine the quality of the protein sequence and to determine the sequence of the N-terminal amino acids. Growth inhibition of omental capillary endothelial cell lines was demonstrated by addition of 1 μ M or more. The above results show that the growth of retinal capillary endothelial cells is inhibited by high homology.