アミノ酸トランスポーター遺伝子の転写活性調節による網膜血管新生阻害法の開発

开发通过调节氨基酸转运蛋白基因转录活性抑制视网膜血管生成的方法

• 批准号: 19659035
• 负责人: 細谷 健一
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: University of Toyama
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19659035/
• 关键词: アミノ酸トランスポター; LAT1; プロモーター解析; 糖尿病網膜症; 血管新生; Dual-luciferase assay

糖尿病網膜症の悪化要因の一つは、網膜基部の血管が閉塞し網膜への栄養供給が滞ることを主な引き金とする「血管新生」である。本研究では、申請者の仮説「糖尿病網膜症において、網膜毛細血管内皮細胞のL型中性アミノ酸トランスポーター(LAT1)は転写活性を亢進させ、内皮細胞の異常増殖を促進している。そこで、LAT1の転写活性化阻害因子を同定し、内皮細胞へのアミノ酸供給を遮断することによって、網膜血管新生を抑制できる。」を証明し、LAT1を分子標的として網膜血管新生を阻害する方法を開発につなげることを目的とした。プロモーター領域を合むLAT1遺伝子の上流を組み込んだconstructsを作製し、条件的不死化ラット網膜毛細血管内皮細胞株(TR-iBRB2細胞)にトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞をglucose不含培地で培養し、Dual-luciferase assay法を用いてLAT1プロモーター活性の変動を解析した。また、glucose枯渇時のLAT1プロモーター活性化に関与する転写因子について、Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)法を用いて解析した。Dual-luciferase assayの結果、-1958/+70 constructにおいてglucose不含培地による培養時間依存的にluciferase活性の上昇が示され、培養18時間では1.66倍増加した。さらに、欠失解析を行ったところ、-106/+70 constructで示された活性上昇は、-185/+70 constructで示された活性上昇から有意に38.0%低下した。また、-162 bp/-155 bpの間で変異処理を行ったconstructsでは、変異処理を施していないconstructsと比較してglucose枯渇によるluciferase活性の上昇が最大で73.9%低下した。これらの結果、glucose枯渇時のLAT-1活性化に-162bp/-157 bpに存在するE-boxが関与していることが示唆された。EMSA解析の結果、-171 bp/-148 bpの標識プローブと核タンパク抽出物を反応させた条件においてバンドが検出された。一方、非標識プローブを過剰量加えた条件および-162 bp/-158 bpに変異を施したプローブを核タンパク抽出物と反応させた条件では、バンドが検出されなかった。さらに、USF1およびUSF2に対する抗体を加えた条件では、バンドがsupershiftした。従って、-162 bp/-157 bpのE-boxにUSF1およびUSF2が結合することが示された。以上の結果から、TR-iBRB2細胞におけるglucose枯渇時のLAT1活性化は、LAT1の上流-162 bp/-157 bpに位置するE-boxが関与したプロモーター活性の上昇に起因することが示唆された。さらに、このE-boxにはUSF1およびUSF2が結合することが明らかとなった。

の diabetic retinopathy 悪 is changed by a つ の は, base の vessels が occlusion し retinal へ の tech students.their ownship raise supply が hysteresis る こ と を Lord な き gold と す る "angiogenesis" で あ る. This study で は, applicants の 仮 said "に diabetic retinopathy お い て, retinal capillary endothelial cells の L neutral ア ミ ノ acid ト ラ ン ス ポ ー タ ー (LAT1) は planning write activity を hyperthyroidism さ せ, endothelial cell の abnormal rights colonization を promote し て い る. そ こ で, LAT1 の planning write activeness with resistance to harm factor を し, endothelial cell へ の ア ミ ノ acid supply を interrupt す る こ と に よ っ て, retinal angiogenesis を suppression で き る." を し, LAT1 を molecular mark と し て retinal angiogenesis を resistance against す る method を open 発 に つ な げ る こ と を purpose と し た. を プ ロ モ ー タ ー field or む LAT1 posthumous son 伝 の upper を group み 込 ん だ constructs を cropping し, conditions of undead ラ ッ ト retinal capillary endothelial cell line (TR - iBRB2 cells) に ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し た. ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン, cell を after glucose does not contain the petty で し, Dual - luciferase assay method を with い て LAT1 プ ロ モ ー タ ー active の - dynamic analytical し を た. ま た, glucose, withered when 渇 の LAT1 プ ロ モ ー タ ー activeness に masato and す る planning write factor に つ い て, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) method を with い て parsing し た. The results of the Dual-luciferase assay <e:1> showed that -1958/+70 constructにお にお て てglucose without the による culture time dependent にluciferase activity <e:1> increased が, indicating that され and 18 time で increased by 1.66 times た. さ ら に line, owe loss analytic を っ た と こ ろ, 70-106 / + construct で shown さ れ た activity rose は, - 185 / + 70 constructed で shown さ れ た activity rise か ら intentionally に 38.0% low し た. ま た and bp / - 155-162 between bp の で line - different 処 reason を っ た constructs で は, - different 処 を shi し て い な い constructs と compare し て glucose withered 渇 に よ る luciferase activity の が で biggest 73.9% low し た. こ れ ら の results, glucose when withered 渇 の activeness に LAT - 1-162 bp / - 157 bp に exist す る E - box が masato and し て い る こ と が in stopping さ れ た. EMSA parsing の results and bp / - 148-171 bp の logo プ ロ ー ブ と nuclear タ ン パ ク extract を anti 応 さ せ た conditions に お い て バ ン ド が 検 out さ れ た. One party, the logo プ ロ ー ブ を than turning volume plus え た conditions お よ び - bp / 162-158 bp に - different を shi し た プ ロ ー ブ を nuclear タ ン パ ク extract と anti 応 さ せ た conditions で は, バ ン ド が 検 out さ れ な か っ た. さ ら に, USF1 お よ び USF2 に す seaborne る antibody を plus え た conditions で は, バ ン ド が supershift し た. 従 っ て and bp/bp の E - 157-162 - box に USF1 お よ び USF2 が combining す る こ と が shown さ れ た. の above results か ら, TR - iBRB2 cell に お け る glucose when withered 渇 の LAT1 activeness は, LAT1 の upper position - bp / 162-157 bp に す る E - box が masato and し た プ ロ モ ー タ ー active の rise に cause す る こ と が in stopping さ れ た. Youdaoplaceholder0, <s:1> <s:1> E-boxに ら USF1およびUSF2が combined with する とが とが and ら となった.

项目成果

Transcriptional regulation of L-type amino acid transporter 1(LAT-1)gene in the retinal capillary endothelial cells under the glucose depleted conditions

葡萄糖耗尽条件下视网膜毛细血管内皮细胞L型氨基酸转运蛋白1(LAT-1)基因的转录调控

• 发表时间: 2008
• 作者: 大保和之、白川峰征;他;R.Matsuyama
• 通讯作者: R.Matsuyama

虚血条件下における網膜毛細血管内皮細胞LAT-1のプロモーター機能解析

缺血条件下视网膜毛细血管内皮细胞LAT-1启动子功能分析

• 发表时间: 2008
• 作者: Kageyama H;et al.;松山 涼
• 通讯作者: 松山 涼

虚血条件下における網膜毛細血管内皮細胞LAT-1の発現及び機能変動

缺血条件下视网膜毛细血管内皮细胞LAT-1的表达及功能变化

• 发表时间: 2007
• 作者: 阿部倫明;豊原敬文;鈴木健弘;秋山泰利;種本雅之;伊藤貞嘉;阿部高明;松山 涼
• 通讯作者: 松山 涼

Inner blood-retinal barrier transport and drug delivery to the retina

内血视网膜屏障转运和药物递送至视网膜

• 发表时间: 2007
• 作者: 大平未佳;藤原淳子;石塚静江;佐藤淳子;渡辺さち子;阿部倫明;阿部高明;賀来満夫;K.Hosoya
• 通讯作者: K.Hosoya

Ocular Transporters and Drug Delivery

眼部转运蛋白和药物输送

• 发表时间: 2008
• 作者: 太向勇;菅尾光太郎;廣瀬謙造;M.Tomi
• 通讯作者: M.Tomi