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アミノ酸トランスポーター遺伝子の転写活性調節による網膜血管新生阻害法の開発

开发通过调节氨基酸转运蛋白基因转录活性抑制视网膜血管生成的方法

基本信息

批准号：
19659035
负责人：
細谷健一
金额：
$ 2.11万
依托单位：
University of Toyama
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

糖尿病網膜症の悪化要因の一つは、網膜基部の血管が閉塞し網膜への栄養供給が滞ることを主な引き金とする「血管新生」である。本研究では、申請者の仮説「糖尿病網膜症において、網膜毛細血管内皮細胞のL型中性アミノ酸トランスポーター(LAT1)は転写活性を亢進させ、内皮細胞の異常増殖を促進している。そこで、LAT1の転写活性化阻害因子を同定し、内皮細胞へのアミノ酸供給を遮断することによって、網膜血管新生を抑制できる。」を証明し、LAT1を分子標的として網膜血管新生を阻害する方法を開発につなげることを目的とした。プロモーター領域を合むLAT1遺伝子の上流を組み込んだconstructsを作製し、条件的不死化ラット網膜毛細血管内皮細胞株(TR-iBRB2細胞)にトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞をglucose不含培地で培養し、Dual-luciferase assay法を用いてLAT1プロモーター活性の変動を解析した。また、glucose枯渇時のLAT1プロモーター活性化に関与する転写因子について、Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)法を用いて解析した。Dual-luciferase assayの結果、-1958/+70 constructにおいてglucose不含培地による培養時間依存的にluciferase活性の上昇が示され、培養18時間では1.66倍増加した。さらに、欠失解析を行ったところ、-106/+70 constructで示された活性上昇は、-185/+70 constructで示された活性上昇から有意に38.0%低下した。また、-162 bp/-155 bpの間で変異処理を行ったconstructsでは、変異処理を施していないconstructsと比較してglucose枯渇によるluciferase活性の上昇が最大で73.9%低下した。これらの結果、glucose枯渇時のLAT-1活性化に-162bp/-157 bpに存在するE-boxが関与していることが示唆された。EMSA解析の結果、-171 bp/-148 bpの標識プローブと核タンパク抽出物を反応させた条件においてバンドが検出された。一方、非標識プローブを過剰量加えた条件および-162 bp/-158 bpに変異を施したプローブを核タンパク抽出物と反応させた条件では、バンドが検出されなかった。さらに、USF1およびUSF2に対する抗体を加えた条件では、バンドがsupershiftした。従って、-162 bp/-157 bpのE-boxにUSF1およびUSF2が結合することが示された。以上の結果から、TR-iBRB2細胞におけるglucose枯渇時のLAT1活性化は、LAT1の上流-162 bp/-157 bpに位置するE-boxが関与したプロモーター活性の上昇に起因することが示唆された。さらに、このE-boxにはUSF1およびUSF2が結合することが明らかとなった。

The main causes of diabetic retinopathy are: blood vessels at the base of the retina are red, blood vessels at the base of the base of the retina are red, blood vessels at the base of the base of the retina are red blood vessels at the base of the base of the retina are red blood vessels at the base of the base of the retina, blood vessels at This study was conducted in response to the applicant's statement,"In diabetic retinopathy, L-type neutral acid (LAT1) reverse transcription activity of retinal capillary endothelial cells is increased, and abnormal proliferation of endothelial cells is promoted." The inhibition factors of LAT1 and LAT 1 activation are regulated simultaneously, the inhibition of endothelial cell acid supply and the inhibition of retinal angiogenesis." To prove that LAT1 molecular targets to prevent retinal angiogenesis, the method of development The up-stream components of LAT1 gene were constructed to control the growth of retinal capillary endothelial cell line (TR-iBRB2 cells). After incubation, glucose was isolated from the cells and the activity of glucose was analyzed by the Dual-Luciferase assay. The LAT1 activation factor and the Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) method are used for analysis. The results of Dual-luciferase assay showed that the increase of luciferase activity in-1958/+70 construct was 1.66 fold without culture time. The activity of the-106/+70 construct was increased, while the activity of the-185/+70 construct was decreased. The maximum increase in luciferase activity was 73.9% lower than that in the control group. As a result, LAT-1 activation at-162 bp/-157 bp in glucose depletion was associated with the presence of an E-box. EMSA analysis results,-171 bp/-148 bp identification and extraction conditions A side, non-identification, and quantity increase condition is-162 bp/-158 bp, and a side, non-identification, and quantity increase condition is-162 bp. USF1 and USF2 are the conditions for supershift. USF1 and USF2 are combined in the E-box of-162 bp and-157 bp. The above results indicate that LAT1 activation in TR-iBRB2 cells during glucose depletion and the E-box at-162 bp/-157 bp upstream of LAT1 are related to the cause of increased LAT1 activity. USF1 and USF2 are combined in this E-box.