FRETによるプロテオリシスのin situ可視化の試み

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組織型プラスミノーゲンアクチベータ(tPA)をモデルにFRETによるプロテアーゼ活性の検出を試みた。tPAの基質であるマウス・プレプロプラスミノーゲンは812アミノ酸からなるが、581番目のアルギニンのC末側でtPAによる切断・活性化を受ける。この近辺の21アミノ酸をリンカーにしてEYFPとECFPを連結したFRETコンストラクトを作製して、プロテアーゼ活性の可視化を試みた。tPAの基質として作製したEYFP-PLG-ECFPをHEK293細胞に導入して、G418に対する耐性を指標に発現株の取得を行ったが、継代を重ねるにつれて発現細胞の減少が認められた。そこで、このEYFP-PLG-ECFPのN末端にHis-tagを導入して大腸菌にて発現させた。封入体を尿素を含む緩衝液で溶解した後、キレートカラムを用いてEYFP-PLG-ECFPを精製した。精製したEYFP-PLG-ECFPはFRETを示し、430nmの励起光に対して530nmの蛍光を発した。しかしながら、これにtPAを作用させると生理的な切断サイトのみならず、EYFPやECFPに対しても分解活性を示すようで蛍光の発生が消失したことから、GFP変異体のプロテアーゼ感受性を低減させる必要が示唆された。