FRETによるプロテオリシスのin situ可視化の試み

尝试使用 FRET 观察原位蛋白水解作用

• 批准号: 15659047
• 负责人: 三井 真一
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Kochi University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15659047/
• 关键词: セリンプロテアーゼ; tissue plasminogen activator; plasminogen; FRET; プロテオリシス

組織型プラスミノーゲンアクチベータ(tPA)をモデルにFRETによるプロテアーゼ活性の検出を試みた。tPAの基質であるマウス・プレプロプラスミノーゲンは812アミノ酸からなるが、581番目のアルギニンのC末側でtPAによる切断・活性化を受ける。この近辺の21アミノ酸をリンカーにしてEYFPとECFPを連結したFRETコンストラクトを作製して、プロテアーゼ活性の可視化を試みた。tPAの基質として作製したEYFP-PLG-ECFPをHEK293細胞に導入して、G418に対する耐性を指標に発現株の取得を行ったが、継代を重ねるにつれて発現細胞の減少が認められた。そこで、このEYFP-PLG-ECFPのN末端にHis-tagを導入して大腸菌にて発現させた。封入体を尿素を含む緩衝液で溶解した後、キレートカラムを用いてEYFP-PLG-ECFPを精製した。精製したEYFP-PLG-ECFPはFRETを示し、430nmの励起光に対して530nmの蛍光を発した。しかしながら、これにtPAを作用させると生理的な切断サイトのみならず、EYFPやECFPに対しても分解活性を示すようで蛍光の発生が消失したことから、GFP変異体のプロテアーゼ感受性を低減させる必要が示唆された。

The organization type is selected from the group consisting of FRET, TPA and TPA. tPA matrix is activated by 812 - 581 - 582 - 581 - 881 - 80 - 881 - 81 - 80- This is the first time that EYFP and ECFP have been linked to each other. tPA matrix control EYFP-PLG-ECFP HEK293 cell introduction, G418 resistance indicators, plant acquisition, generation, and cell reduction. EYFP-PLG-ECFP N-terminal His-tag was introduced into E. coli. After dissolution of the encapsulated substance in a buffer solution containing urea, EYFP-PLG-ECFP was used for purification. The EYFP-PLG-ECFP is a perfect system for FRET emission, excitation emission at 430nm and emission emission at 530 nm. EYFP is the most effective way to reduce the sensitivity of human beings.