二重鎖RNAを投与した培養脳細胞系を用いた重度脳発達障害の発症機序の解明

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研究代表者らは、愛知県コロニー中央病院で加療している(重度)知的障害の症例より新規病因遺伝子を同定し、機能解析を行っている。本年度は、我々が今までに同定した下記の3種類の新規病因遺伝子について、その発現を特異的にノックダウンするsiRNAをマウスとヒトについて同定した。さらに、同siRNAを過剰発現する細胞クローンをP19細胞より単離した。1)ZEHX1B(重度の知的障害と神経堤障害を呈する疾患の病因遺伝子)2)PLEKHA5(染色体6q16と12p12に相互転座の見られる最重度精神運動発達遅滞の症例の12p12転座断点部に局在する遺伝子)3)CHD6(chromodomain helicase DNA binding protein 6、染色体4q33と20q13に相互転座の見られ中等度の知的障害を呈する症例の20q13の転座断点部に局在する遺伝子)方法:ヒトとマウスの上記遺伝子(6種類)のcDNAの5'端のATGから600-800bpを含むsiCHECKベクターを作製し、各々の遺伝子に対するsiRNAを数箇所上記cDNA内より決定し、発現するベクター(pSUPER:蛍光蛋白質であるGFPを発現する遺伝子を含む)にサブクローニング後、293細胞にトランスフェクションした。その結果、目的の遺伝子を約70-80%ノックダウンする6種類のsiRNAを同定した。これらのSiRNAを過剰発現するベクターを293細胞にトランスフェクションし、各運伝子の発現量をRT-PCRで定量すると約40-50%に低下していた。遺伝子の導入効率を約80%と考えるとsiCHECKベクターを用いた時と同様の結果を得た。P19細胞を用いた機能解析:現在、マウスP19細胞にPlekha5とChd6を効果的にノックダウンするsiRNAを過剰発現するベクターをトランスフェクションし、G418を含んだ培地で培養後、薬剤耐性クローンを得た。今後、Zfhx1bについても同様のクローンを単離後、P19細胞をレチノ酸で処理し、神経細胞に分化させた後に、同細胞の機能を解析する予定である。