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二重鎖RNAを投与した培養脳細胞系を用いた重度脳発達障害の発症機序の解明

使用给予双链 RNA 的培养脑细胞系阐明严重脑发育障碍的发病机制

基本信息

批准号：
15659256
负责人：
若松延昭
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Institute for Developmental Research, Aichi Human Service Center
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15659256/
关键词：
siRNA ZFHX1B PLEKHA5 CHD6 P19細胞ノックダウン知的障害

项目摘要

研究代表者らは、愛知県コロニー中央病院で加療している(重度)知的障害の症例より新規病因遺伝子を同定し、機能解析を行っている。本年度は、我々が今までに同定した下記の3種類の新規病因遺伝子について、その発現を特異的にノックダウンするsiRNAをマウスとヒトについて同定した。さらに、同siRNAを過剰発現する細胞クローンをP19細胞より単離した。1)ZEHX1B(重度の知的障害と神経堤障害を呈する疾患の病因遺伝子)2)PLEKHA5(染色体6q16と12p12に相互転座の見られる最重度精神運動発達遅滞の症例の12p12転座断点部に局在する遺伝子)3)CHD6(chromodomain helicase DNA binding protein 6、染色体4q33と20q13に相互転座の見られ中等度の知的障害を呈する症例の20q13の転座断点部に局在する遺伝子)方法:ヒトとマウスの上記遺伝子(6種類)のcDNAの5'端のATGから600-800bpを含むsiCHECKベクターを作製し、各々の遺伝子に対するsiRNAを数箇所上記cDNA内より決定し、発現するベクター(pSUPER:蛍光蛋白質であるGFPを発現する遺伝子を含む)にサブクローニング後、293細胞にトランスフェクションした。その結果、目的の遺伝子を約70-80%ノックダウンする6種類のsiRNAを同定した。これらのSiRNAを過剰発現するベクターを293細胞にトランスフェクションし、各運伝子の発現量をRT-PCRで定量すると約40-50%に低下していた。遺伝子の導入効率を約80%と考えるとsiCHECKベクターを用いた時と同様の結果を得た。P19細胞を用いた機能解析:現在、マウスP19細胞にPlekha5とChd6を効果的にノックダウンするsiRNAを過剰発現するベクターをトランスフェクションし、G418を含んだ培地で培養後、薬剤耐性クローンを得た。今後、Zfhx1bについても同様のクローンを単離後、P19細胞をレチノ酸で処理し、神経細胞に分化させた後に、同細胞の機能を解析する予定である。

The research representative, Aichi Central Hospital, conducted a new study on the identification and functional analysis of the causes of severe and severe disorders. This year, we have identified three new types of pathogenic genes, including siRNA, and siRNA that are specific to the development of the disease. In addition, siRNA were detected in P19 cells. 1)ZEHX1B (Severe cognitive impairment and neurologic impairment present etiological factors of the disease)2)PLEKHA5 (Chromosome 6q16 and 12p12 are located at the intersection of the most severe psychomotor disorders and the 12p12 breakpoint is located at the intersection)3)CHD6 (Chromodomain helicase DNA binding protein 6, chromosome 4q33 and chromosome 20 q13 are located at the breakpoint of locus 20 q13.) The ATG at the 5'-end of cDNA of the six types of cDNA contains siRNAs, siRNAs and siRNAs corresponding to each gene. Light protein is produced by GFP, which is contained in the protein. The protein is produced by GFP and 293 cells. About 70-80% of the target siRNAs were identified. The expression of these siRNAs in 293 cells was about 40-50% lower than that in RT-PCR. About 80% of the samples were imported. P19 cell function analysis: now, P19 cells in Plekha5 and Chd6, the fruit of the siRNA development, G418, including culture, the resistance to the disease. In the future, Zfhx1b cells will be separated from each other, P19 cells will be treated with acid, neurons will be differentiated, and the functions of the same cells will be analyzed.

项目成果

期刊论文数量（10）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Mizunuma M, Yamada Y, Yamada K, Wakamatsu N, et al.: "Disruption in the hypoxanthine phosphoribosyltransferase gene caused by translocation in a patient with Lesch-Nyhan syndrome."Nucleosides Nucleotides and Nucleic Acid. (in press). (2004)

Mizunuma M、Yamada Y、Yamada K、Wakamatsu N 等人：“Lesch-Nyhan 综合征患者易位导致次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因破坏。” 核苷核苷酸和核酸。

DOI：
发表时间：
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

MECP2遺伝子異常を伴うRett症候群の臨床症状について.

与 MECP2 基因异常相关的 Rett 综合征的临床症状。

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
脳と発達 37・1
影响因子：
0
作者：
三浦清邦;他
通讯作者：
他

Disruption in the hypoxanthine phosphoribosyltransferase gene caused by translocation in a patient with Lesch-Nyhan syndrome

Lesch-Nyhan 综合征患者易位导致次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因破坏

DOI：
发表时间：
2004
期刊：
Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 23
影响因子：
0
作者：
Mizunuma M;Yamada Y;Yamada K;Santa S;Wakamatsu N;Kaneko K;Ogasawara N;Fujimori S
通讯作者：
Fujimori S

Mutations in the hypoxanthine guanine phosphoribosyltrans-ferase gene (HPRT1) in Asian HPRT deficient families.

亚洲 HPRT 缺陷家族中次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因 (HPRT1) 的突变。