植物の根表層工学の開発

目的タンパク質を細胞外分泌した後、細胞壁にトラップすることが可能になれば、環境浄化酵素の機能を引き出す上で有効であると考えられる。PRXによるフェノールの除去は、植物細胞壁にフェノールが酸化重合されることにより行われるが、このような反応系では、PRXを細胞壁に固定化することで細胞壁へのフェノール結合効率の上昇が期待される。細胞壁結合ドメインとしてArabidopsis thaliana EXP1由来Cellulose Binding Domain(CBD)およびNitociana tabacum TLRP由来Cys-rich Domain(Cys-D)の利用を検討した。まず、細胞壁結合ドメインを融合した組み換えタンパク質を植物体根に添加し、各ドメインの機能評価を行う。緑色蛍光タンパク質(EGFP)をレポーターとして用い、各組み換えタンパク質を発現するための遺伝子構築を行った。大腸菌に導入後、IPTGによる転写誘導を行い、各組み換えタンパク質が生産されることを確認した。現在、各組み換えタンパク質の大量生産および精製を行う。植物細胞壁に各組み換えタンパク質を添加し、緑色蛍光を見ることで細胞壁との結合性を評価を行っている。次に、CBDもしくはCys-DとHRP C1aの融合遺伝子にN末端分泌シグナルペプチドコード領域を融合した各遺伝子を、アグロバクテリウム法によりタバコ培養細胞に導入した。得られた形質転換カルスからタンパク質サンプルを調製して等電点電気泳動およびペルオキシダーゼ活性染色を行い、HRP C1aを発現するクローンを選抜した。これらのうち、Cys-D発現細胞の培地上清および細胞可溶性画分を調製し、等電点電気泳動を行い、細胞内と培養上清の両方に組換えタンパク質の生成が確認された。

目的タンパク質を細胞外分泌した後、細胞壁にトラップすることが可能になれば、環境浄化酵素の機能を引き出す上で有効であると考えられる。PRXによるフェノールの除去は、植物細胞壁にフェノールが酸化重合されることにより行われるが、このような反応系では、PRXを細胞壁に固定化することで細胞壁へのフェノール結合効率の上昇が期待される。細胞壁結合ドメインとしてArabidopsis thaliana EXP1由来Cellulose Binding Domain(CBD)およびNitociana tabacum TLRP由来Cys-rich Domain(Cys-D)の利用を検討した。まず、細胞壁結合ドメインを融合した組み換えタンパク質を植物体根に添加し、各ドメインの機能評価を行う。緑色蛍光タンパク質(EGFP)をレポーターとして用い、各組み換えタンパク質を発現するための遺伝子構築を行った。大腸菌に導入後、IPTGによる転写誘導を行い、各組み換えタンパク質が生産されることを確認した。現在、各組み換えタンパク質の大量生産および精製を行う。植物細胞壁に各組み換えタンパク質を添加し、緑色蛍光を見ることで細胞壁との結合性を評価を行っている。次に、CBDもしくはCys-DとHRP C1aの融合遺伝子にN末端分泌シグナルペプチドコード領域を融合した各遺伝子を、アグロバクテリウム法によりタバコ培養細胞に導入した。得られた形質転換カルスからタンパク質サンプルを調製して等電点電気泳動およびペルオキシダーゼ活性染色を行い、HRP C1aを発現するクローンを選抜した。これらのうち、Cys-D発現細胞の培地上清および細胞可溶性画分を調製し、等電点電気泳動を行い、細胞内と培養上清の両方に組換えタンパク質の生成が確認された。