SH3ドメインに高親和性・特異的ペプチドの立体構造に基づいたライブラリデザイン

基于对 SH3 结构域具有高亲和力和特异性的肽 3D 结构的文库设计

基本信息

批准号：
16657045
负责人：
神田大輔
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

SH3ドメインはプロリンリッチ配列(PXXP配列)に結合するドメインである。市販のファージライブラリPh.D.-C7Cファージディスプレイペプチドライブラリキット(BioLabs社)を用いて,p67^<phox>蛋白質のSH3ドメインに結合するペプチドを選択した.p67^<phox>蛋白質のSH3ドメインをGST融合タンパク質として大腸菌を用いて発現・精製した.Glutathione coated96穴HS plateプレートを用いてGST部分でプラスチックに結合させ,方向が制御された状態の固相化をおこなった.また,溶液中での選択を行うためGST Magnet Agarose Beadsを用いてプルダウンを行った.特異的に吸着したファージを溶出し、大腸菌に感染させ、プラークを得た。このパンニング操作を3回繰り返した。結果はファージELISAを使って確認した.ファージライブラリPh.D.-C7Cペプチドライブラリキットは,7残基のランダムライブラリであり,両端のシステインがSS結合を形成して環化している.PXXPを含む配列が繰り返し得られた.得られた4つのアミノ酸配列をペプチド合成し,SS結合を作らせて環化した.質量分析とDTNBによるSH基の定量で確認した.^<15>Nラベルしたp67^<phox>蛋白質のSH3ドメインを調製した.p67^<phox>SH3はシステイン残基をセリンに変えた変異体であるが,これはリガンドが結合していない状態ではアンフォールドしているが,リガンドが結合するとフォールドする性質をもっている.4種のペプチドのうち1つがSH3ドメインをフォールドさせることができた.このペプチドはSS結合でコンホメーションが制限されているので,通常のポリプロリンヘリックス2型のコンホメーションで結合しているとは考えにくい.NMR測定をおこなって構造情報を収集した.

SH3结构域是结合富含脯氨酸的序列（PXXP序列）的域。商业可用的噬菌体库博士学位-C7C噬菌体展示肽库试剂盒（Biolabs）用于选择与p67^<phox>蛋白质的SH3结构域结合的肽。 p67^<phox>蛋白的SH3结构域用大肠杆菌作为GST融合蛋白表达并纯化。谷胱甘肽涂层的96孔HS板板用于与塑料结合，并将方向固定在受控状态。此外，使用GST磁铁琼脂糖珠进行下拉进行下拉以在溶液中选择。切入了特定吸附的噬菌体，并获得了斑块。此平移操作重复了三次。使用噬菌体ELISA确认结果。噬菌体文库博士学位-C7C肽库试剂盒是一个由7个残基组成的随机库，两端的半胱氨酸形成SS键和环化。重复获得包含PXXP的序列。通过制造SS键合成并环绕获得的四个氨基酸序列。通过质谱和DTNB对SH组进行定量。制备了N标记的p67^<phox>蛋白的SH3结构域。 p67^<phox> sh3是一个突变体，其具有半胱氨酸残基转换为丝氨酸的突变体，当配体没有结合时，它会展开，但是当配体结合时具有折叠的特性。四种类型的肽之一能够折叠SH3域。因为该肽受SS结合的限制，所以它不太可能受到正常的聚丙烯螺旋2构象的结合。我们通过执行NMR测量来收集结构信息。