ミトコンドリア外膜透過装置の立体構造と通過中のポリペプチド鎖のコンホメーション

线粒体外膜渗透器三维结构及传代过程中多肽链构象

基本信息

批准号：
15032239
负责人：
神田大輔
金额：
$ 5.38万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

ミトコンドリア外膜に存在する膜透過装置においてTom40タンパク質がチャネルを形成している。このチャネルのポアを通過して前駆体タンパク質が輸送される。立体構造はβバレルからなるポーリン型であると予想されている.大腸菌を用いて酵母のTom40全長を発現すると,インクルージョンボディとなった.6M尿素を用いて可溶化し,陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて精製を行い、大腸菌1L培養当たり60〜70mgの変成状態のTom40タンパク質を得ることができた。膜タンパク質の立体構造解析においては使用する界面活性剤の選択が鍵となる。そこで、我々はCD、NMR、電子顕微鏡・負染色、ブルーネイティブ-PAGE、界面活性剤存在下でのゲルろ過などを指標として27種類の界面活性剤のスクリーニングを行い、Tom40の巻き戻しに有効であると思われるものを5種類選択した(DDM,OG,SML,Brij35,C_<12>E_6).ついで,Tom40の巻き戻し方法を,希釈法,ゲルろ過に直接インジェクションする方法,ヒスタグを用いてカラムに固定しながら変性剤を取り除く3つの方法について検討した.その結果、ゲルろ過カラムによる巻き戻し法が最も有効であった.ボイドボリュームよりあとの位置のピークから,電子顕微鏡・負染色観察で穴が1つあいたリング状の粒子が確認された.また,CDおよびNMRでβシート構造が含まれることが判明した.しかしながら,安定性が低く1日経過すると変性状態へもどっていた.また,機能的な指標としてのプレタンパク質(pSu9-DHFR)との特異的な結合は検出できなかった.

TOM40蛋白在外部线粒体膜中存在的膜渗透体中形成通道。前体蛋白通过该通道的孔传输。预计三维结构将处于由β枪管组成的孔蛋白形式。当使用大肠杆菌表达酵母中的Tom40的全长时，它变成了包容物。它使用6M尿素溶解并使用阳离子交换柱色谱法纯化，以每1L大肠杆菌培养物获得60-70 mg的变质TOM40蛋白。用于使用的表面活性剂的选择是膜蛋白构象分析的关键。因此，我们使用CD，NMR，电子显微镜和阴性染色，蓝色天然页面，在存在表面活性剂的情况下筛选了27种类型的表面活性剂，并且选择了5种似乎有效的TOM40的表面活性剂（ddm，og，sml，sml，brij35，c_35，c_ c_ <12> e_6）。直接注射到凝胶过滤中，并在使用Histag将其固定到色谱柱时除去变性剂。研究了三种方法。结果，使用凝胶过滤柱的倒带方法最有效。通过电子显微镜和阴性染色观察，从空隙体积后的位置的峰中，带有一个孔的环形颗粒。此外，CD和NMR表明包括β-片的结构。但是，稳定性很低，一天后结构恢复到了变性状态。此外，无法检测到与蛋白蛋白（PSU9-DHFR）作为功能指标的特异性结合。