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ミトコンドリア外膜透過装置の立体構造と通過中のポリペプチド鎖のコンホメーション

线粒体外膜渗透器三维结构及传代过程中多肽链构象

基本信息

批准号：
15032239
负责人：
神田大輔
金额：
$ 5.38万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

ミトコンドリア外膜に存在する膜透過装置においてTom40タンパク質がチャネルを形成している。このチャネルのポアを通過して前駆体タンパク質が輸送される。立体構造はβバレルからなるポーリン型であると予想されている.大腸菌を用いて酵母のTom40全長を発現すると,インクルージョンボディとなった.6M尿素を用いて可溶化し,陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて精製を行い、大腸菌1L培養当たり60〜70mgの変成状態のTom40タンパク質を得ることができた。膜タンパク質の立体構造解析においては使用する界面活性剤の選択が鍵となる。そこで、我々はCD、NMR、電子顕微鏡・負染色、ブルーネイティブ-PAGE、界面活性剤存在下でのゲルろ過などを指標として27種類の界面活性剤のスクリーニングを行い、Tom40の巻き戻しに有効であると思われるものを5種類選択した(DDM,OG,SML,Brij35,C_<12>E_6).ついで,Tom40の巻き戻し方法を,希釈法,ゲルろ過に直接インジェクションする方法,ヒスタグを用いてカラムに固定しながら変性剤を取り除く3つの方法について検討した.その結果、ゲルろ過カラムによる巻き戻し法が最も有効であった.ボイドボリュームよりあとの位置のピークから,電子顕微鏡・負染色観察で穴が1つあいたリング状の粒子が確認された.また,CDおよびNMRでβシート構造が含まれることが判明した.しかしながら,安定性が低く1日経過すると変性状態へもどっていた.また,機能的な指標としてのプレタンパク質(pSu9-DHFR)との特異的な結合は検出できなかった.

The membrane transmission device with the outer membrane is formed by Tom40. This is the first time I've ever seen a person who's been in a relationship with someone who's been in a relationship with me. The three-dimensional structure is β-ray, β-ray and β-ray. Coliform bacteria are used in the production of Tom40 full-length yeast. When the yeast is 60 ~ 70mg, Tom 40 is used in the production of Tom 40 full-length yeast. 6M urea is used in the production of Tom40 full-length yeast. The analysis of the three-dimensional structure of the film is based on the selection of the surfactant. CD, NMR, electron microscope, negative staining, gel electrophoresis, PAGE, 27 kinds of surfactant, Tom40, DDM, <12>OG,SML,Brij35,C_E_6. Tom40's method of searching, searching. The result is that there is no such thing as a complete solution. The position of the electron microscope and negative staining were detected. CD and NMR spectra were analyzed. The stability is low. The stability is low. The index of function and the specific combination of pSu9-DHFR.