フーリエ変換赤外分光分析法を用いた細胞内化学反応の直接定量法の開発

利用傅里叶变换红外光谱法开发细胞内化学反应的直接定量方法

• 批准号: 16658041
• 负责人: 宮崎 均
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16658041/
• 关键词: FT-IR; 赤外分光分析; 半導体

有機化合物は赤外波長領域(2.5-25μm)において、官能基等に依存した固有の吸収スペクトルを持つ。本研究では、(1)細胞内シグナル伝達の中心をなすキナーゼとホスファターゼの活性を、フーリエ変換赤外分光法(FT-IR)を用いて簡便にin vitro測定する手法を確立する、(2)これを発展させ、大腸菌内で非破壊的に、すなわちin situでキナーゼの変異と活性相関を解析するシステムを開発する、ことである。(1)に関しては、キナーゼ反応に共役して起こる「ATP→ADP+リン酸」の反応を利用した.リン酸基に帰属する特有のスペクトルが1200cm^<-1>以下の波数領域に現れ、リン酸基を3つ持つATPと2つ持つADPの間で、明らかに異なるスペクトルが観察され、ATPからADPの変化を定量化することに成功した。この系を用い、微生物由来の可溶性ATPaseとその基質であるATPを反応させると、リアルタイムで「ATP→ADP+リン酸」の変化が観察され、少なくとも、様々な生化学反応に連動しておこるATPase活性のFT-IRを用いた定量の基本形が確立された。現時点での感度は200μM程度であり、感度を上げるために検出器を改良中である。また、より少量での測定を可能にするためセルも改良中である。さらに、上記は赤外線の透過を測定しているが、感度および測定の簡便さを追求するため、同時に半導体を用いた多重反射によるスペクトル観察も行っている.現在のところ透過に比べ感度が落ちるが、セルや半導体の材質を変えるなど検討中である。

Organic compounds depend on their intrinsic absorption properties in the red wavelength range (2.5-25μm), functional groups, etc. This study was conducted to: (1) establish a simple method for determining the activity of the enzyme in vitro by FT-IR;(2) develop a method for analyzing the activity of the enzyme in Escherichia coli. (1)In this case, the ATP→ADP+ acid reaction is used. The results showed that the acid group was found in the range of wave number below 1200 cm ^<-1>, and the acid group was successfully quantified by ATP and ADP. The basic form of ATP→ADP+ ATPase transformation was established for the detection of ATP →ADP+ ATPase in the system, microorganism-derived soluble ATPase and substrate, and for the quantification of ATP → ADP + ATPase activity using FT-IR. The sensitivity of the current point is 200μM. A small number of measurements were made. In addition, it is necessary to measure the transmission of infrared rays, sensitivity and simplicity of measurement. At the same time, it is necessary to measure the transmission of infrared rays in semiconductor applications. Now we can see that through the comparison sensitivity, the material of the semiconductor can change.