肝細胞期熱帯熱マラリア原虫の培養系の確立

本研究では、肝細胞期熱帯熱マラリア原虫で発現量の多い遺伝子産物のプロモーター領域を用いて緑色蛍光タンパク質(GFP)で標識した熱帯熱マラリア原虫を作成し、肝細胞期原虫の簡便な検出方法を構築することを最初の目的とし、さらに、この方法を用いてマラリア原虫の肝細胞への感染率の定量化を行うとともに、感染効率のよい培養条件を検討することで、未確立の肝細胞期熱帯熱マラリア原虫の培養系の確立を目指した。初年度は、肝細胞に感染するスポロゾイト期を形成することを実験的に確認した2種類の熱帯熱マラリア原虫株に対して遺伝子導入を行い、Elongation Factor 1(EF1)のプロモーターからGFPおよびLuciferaseを発現しているGFP安定発現熱帯熱マラリア原虫およびLuciferase安定発現熱帯熱マラリア原虫を作成し、これらのマラリア原虫が、赤血球期においてもGFPおよびLuciferaseを発現していることを確認した。昨年度は、これらのGFP安定発現熱帯熱マラリア原虫ゲノムへの発現カセットの組み込みを図ったが、6ヶ月以上にわたり培養を継続しているにもかかわらず、現在のところ、組み込みはみられない。そこで、最近、新しく開発されたpiggyBacトランスポゾンの原理を利用した迅速にゲノムへの組み込みができる遺伝子導入法に方法を変更し、あらたにプラスミドを構築し2種類の熱帯熱マラリア原虫に遺伝子導入を行った。さらにEF1に加え、肝細胞期原虫に発現するHeat Shock ProteinのプロモーターからGFPおよびLuciferaseを発現するコンストラクトを新たに作成した。これらのコンストラクトの薬剤選択マーカーは、最終的に薬剤スクリーニングにも使用することを考慮して、最初のコンストラクト(human DHFR)とは異なるもの(BSD)を用いている。

本研究では、肝細胞期熱帯熱マラリア原虫で発現量の多い遺伝子産物のプロモーター領域を用いて緑色蛍光タンパク質(GFP)で標識した熱帯熱マラリア原虫を作成し、肝細胞期原虫の簡便な検出方法を構築することを最初の目的とし、さらに、この方法を用いてマラリア原虫の肝細胞への感染率の定量化を行うとともに、感染効率のよい培養条件を検討することで、未確立の肝細胞期熱帯熱マラリア原虫の培養系の確立を目指した。初年度は、肝細胞に感染するスポロゾイト期を形成することを実験的に確認した2種類の熱帯熱マラリア原虫株に対して遺伝子導入を行い、Elongation Factor 1(EF1)のプロモーターからGFPおよびLuciferaseを発現しているGFP安定発現熱帯熱マラリア原虫およびLuciferase安定発現熱帯熱マラリア原虫を作成し、これらのマラリア原虫が、赤血球期においてもGFPおよびLuciferaseを発現していることを確認した。昨年度は、これらのGFP安定発現熱帯熱マラリア原虫ゲノムへの発現カセットの組み込みを図ったが、6ヶ月以上にわたり培養を継続しているにもかかわらず、現在のところ、組み込みはみられない。そこで、最近、新しく開発されたpiggyBacトランスポゾンの原理を利用した迅速にゲノムへの組み込みができる遺伝子導入法に方法を変更し、あらたにプラスミドを構築し2種類の熱帯熱マラリア原虫に遺伝子導入を行った。さらにEF1に加え、肝細胞期原虫に発現するHeat Shock ProteinのプロモーターからGFPおよびLuciferaseを発現するコンストラクトを新たに作成した。これらのコンストラクトの薬剤選択マーカーは、最終的に薬剤スクリーニングにも使用することを考慮して、最初のコンストラクト(human DHFR)とは異なるもの(BSD)を用いている。