MALD-TOF法によるTLRシグナル分子相互作用蛋白質の検索法の開発

使用MALD-TOF方法开发TLR信号分子相互作用蛋白搜索方法

• 批准号: 16659500
• 负责人: 花澤 重正
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Nihon University (2005)Kyushu University (2004)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16659500/
• 关键词: TLR; MALD-TOF; 相互作用因子; シグナル伝達; 制御因子; 細菌成分; プロテオーム解析; サイトカイン; マクロファージ; 相互作用蛋白質; 細胞内情報伝達

私達はMALD-TOF法によるTLRシグナル分子相互作用蛋白質の検索法を確立するために、ごく最近示されたSOCSがTLRシグナル分子であるIRAK-4やIRAK-1と相互作用するという知見をもとにHis-Tag融合hSOCS-3組み換えタンパク質を用い、MAD-TOF法をによるその検索法を確立することを試み。以下の結果を得た。1.His-Tag融合hSOCS-3組み換えタンパク質をbaitとしたものと、His-Tagコントロールを、各々HeLa細胞細胞質抽出液と混和した後、精製したHis-Tag及びHis-Tag融合hSOCS-3結合タンパク質群をSDS-PAGE、二次元電気泳動により分離した。2.His-Tag融合hSOCS-3組み換えタンパク質に特異的に結合すると見られるタンパク質スポットをMALDI-TOFMSによる質量分析によって同定した。その結果、13種類のタンパク質を同定できた。3.同定した蛋白質の中で微小管形成中心プラス端集積因子EB1と細胞骨格構成分子であるactinβ(以下、ACTB)が細胞内で相互作用する可能性が高いことがわかった。4.HEK293T細胞にFLAG-hSOCS-3を強制発現させ、FLAG抗体レジンで免疫沈降を行い、EB1抗体とACTB抗体でそれぞれ検出を行った。その結果、hSOCS-3と内因性発現レベルのEB1、ACTBは相互作用することが確認できた。以上、私達はHis-Tag融合hSOCS-3組み換えタンパク質をbaitとし細胞質抽出物より、その結合蛋白質を精製し、その相互作用蛋白質を同定するためのMAD-TOF法を用いた検索法を確立することができた。この方法は歯周疾患病原細菌成分のTLRシグナル伝達系の分子の制御因子を探索する上で有効であると思える。

Private da は MALD - TOF method に よ る TLR シ グ ナ ル molecular interaction protein の 検 を line method to establish す る た め に, ご く recently shown さ れ た SOCS が TLR シ グ ナ ル molecular で あ る IRAK - 4 や IRAK - 1 と interaction す る と い う knowledge を も と に His Tag fusion hSOCS - 3 groups み in え タ ン The パ sub-quality を was established by the する, MAD-TOF method をによるそ, 検 rope method を to determine the する とを とを test み. The following <s:1> result を gives た. 1. His Tag fusion hSOCS - 3 groups み in え タ ン パ ク qualitative を bait と し た も の と, ihs - Tag コ ン ト ロ ー ル を, various 々 HeLa cytoplasm extract と mixed し, refined after た し た ihs - Tag and び His Tag fusion hSOCS - 3 combined タ ン パ ク mass group を SDS - PAG E. Two-dimensional electrical movement によ によ separation た. 2. His Tag fusion hSOCS - 3 groups み in え タ ン パ ク qualitative に specific に combining す る と see ら れ る タ ン パ ク qualitative ス ポ ッ ト を MALDI - TOFMS に よ る quality analysis に よ っ て with fixed し た. Youdaoplaceholder0 そ results, 13 kinds of <s:1> タ パ パ パ を を are the same as で た た た. 3. Be し た protein の で tiny tube forming centre プ ラ ス end set factor EB1 と cell skeleton and molecular で あ る actin (hereinafter, ACTB) が beta cell interaction で す likely が る い こ と が わ か っ た. 4. HEK293T cells に FLAG - hSOCS - 3 を forced 発 now さ せ, FLAG antibody レ ジ ン で immune sink を い, EB1 antibodies と ACTB antibody で そ れ ぞ れ 検 を row っ た. The そ そ results, the endogenous occurrence of hSOCS-3と, レベ <s:1> EB1, ACTB <s:1> interaction する で とが confirmed で た た. Above, private は His Tag fusion hSOCS - 3 groups み in え タ ン パ ク qualitative を bait と し cytoplasm extract よ り, そ の binding protein を refined し, そ の を interaction proteins might be す る た め の を MAD - TOF method with い た 検 を line method to establish す る こ と が で き た. こ の way は 歯 week diseases pathogenic bacteria composition の TLR シ グ ナ ル 伝 da is の molecular の suppression factor を explore す る で have sharper で あ る と think え る.

项目成果

Adiponectin inhibits Toll-like receptor family-induced signaling

• DOI: 10.1016/j.febslet.2005.11.019
• 发表时间: 2005-12-19
• 期刊: FEBS LETTERS
• 影响因子: 3.5
• 作者: Yamaguchi, N;Guillermo, J;Yamashita, Y
• 通讯作者: Yamashita, Y

Identification and characterization of novel isoforms of human DP-1 : DP-1 {alpha} regulates the transcriptional activity of E2F1 as well as cell cycle progression in a dominant-negative manner.

人类 DP-1 新型亚型的鉴定和表征：DP-1 {α} 以显性失活方式调节 E2F1 的转录活性以及细胞周期进程。

• 发表时间: 2005
• 期刊: J.Biol.Chem 280(26)
• 作者: Ishida;H.;Masuhiro;Y.;Hanazawa;S.他4名
• 通讯作者: S.他4名

Interleukin-6 negatively regulates Porphyromonas gingivalis fimbria-stimulated fibronectin expression in human gingival fibroblasts.

Interleukin-6 负向调节人牙龈成纤维细胞中牙龈卟啉单胞菌菌毛刺激的纤连蛋白表达。

• 发表时间: 2005
• 期刊: FEMS Immunol.Med.Microbiol. 43・2
• 作者: Murakami Y;Shoji M;Hirata A;Tanaka S;Hanazawa S;Fujisawa S.
• 通讯作者: Fujisawa S.

Tumor necrosis factor alpha enhances Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin-induced HL-60 cell apoptosis by stimulating lymphocyte function-associated antigen 1 expression

肿瘤坏死因子α通过刺激淋巴细胞功能相关抗原1表达增强伴放线放线杆菌白毒素诱导的HL-60细胞凋亡

• 发表时间: 2004
• 期刊: Infect.Immun. 72・1
• 作者: Yamaguchi N;Kubo C;Masuhiro Y;Lally ET;Koga T;Hanazawa S.
• 通讯作者: Hanazawa S.

Interleukin-1 stimulates cytokines, prostaglandin E2 and matrix metalloproteinase-1 production via activation of MAPK/AP-1 and NF-

Interleukin-1 通过激活 MAPK/AP-1 和 NF- 刺激细胞因子、前列腺素 E2 和基质金属蛋白酶-1 的产生

• 发表时间: 2005
• 期刊: Cytokine 29(4)
• 作者: Murakami Y;Shoji M;Hirata A;Tanaka S;Hanazawa S;Fujisawa S.;Murakami Y. et al.;Kida Y.et al.
• 通讯作者: Kida Y.et al.