ブリッジヌクレオチド法による遺伝子cDNAの迅速(1日以内)クローニング法の開発

使用桥核苷酸法开发基因 cDNA 快速（1 天内）克隆方法

• 批准号: 17651113
• 负责人: 榎本 平
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17651113/
• 关键词: 遺伝子クローニング; ブリッジヌクレオチド法; oligo(dG)latex bead; cDNAクローニング法; oligo(dG) latex bead; cDNA; oligo (dG) latex bead

モデル実験系(blue or white colony形成plasmid)とシロイヌナズナcDNA libraryを用いた迅速クローニング法の高速化の検討1)ブリッジヌクレオチド法で回収されたDNA plasmidの高温・再ハイブリによる回収効率上昇の再検討昨年に、DNAの変性=1本鎖化の過程で物理的に1箇所以上切断されたターゲットcDNAを回収する方法をモデル実験系で開発したが、この切断された後に再構成・回収されたcDNAが元のcDNAと同じ塩基配列を示すのかどうか、DNAシークエンスを行うことで今回検証した。方法としてはモデルプラスミドpCYとpGBMのMCS部位の制限酵素切断部位を切断し、切断していないプラスミドと混合・変性・再構成し、大腸菌にトランスフェクトして、得られたクローンからプラスミドDNAを精製し、DNAシークエンスして比較した。その結果、調べた25回収クローンにおいてすべて切断部位の配列は、元のcDNAクローンと同一であることが明らかとなった。この結果により、切断再構成され、回収されたクローンも目的のターゲットクローンと同一であると推測された。2)シロイヌナズナcDNA libraryからの光合成遺伝子Rubisco遺伝子のクローニングの試みこの方法の有効性を確かめるため、シロイヌナズナcDNA libraryから光合成過程の炭素固定に重要な遺伝子Rubisco cDNAの迅速クローニングを試みた。方法は、これまで通りのsuper-coiled cDNA plasmidをターゲットとする方法と、今回開発したBN回収・再構成法で得られたクローンをPCR法で確認し、比較した。結果は、super-coil/BN法に比べBN回収・再構成法は2-6倍のクローンをえることができた。

モデル実験系(blue or white colony forming plasmid): DNA library: rapid amplification method: rapid amplification method: rapid amplification This is the first time that a DNA fragment has been cloned into a cDNA fragment. The method includes cutting off the restriction enzyme of MCS site of pCY and pGBM, mixing, reconstituting, purifying DNA from Escherichia coli, and comparing DNA with other methods. As a result, the 25-fold sequence of cDNA fragments was identified. The result is that the structure is cut off and the target is recovered. 2) Rubisco cDNA library is an important gene for carbon fixation in photosynthetic process. Methods: The super-coated cDNA plasmid was identified by PCR and compared with the present method. The results show that the super-coil/BN method is 2-6 times higher than the BN method.

项目成果

高速で効率の良いcDNA・genome遺伝子のクローニング法=One Day Cloning法=

快速高效的cDNA/基因组基因克隆方法=一日克隆方法=

• 发表时间: 2005
• 期刊: バイオテクノロジージャーナル Vol5・No5
• 作者: H. Watanabe;T. Enomnoto;S. Tanaka;榎本 平
• 通讯作者: 榎本 平

Ab initio study of molecular interactions in higher plant and Galdieria partita Rubisco with the fragment molecular orbital method

用碎片分子轨道法从头开始研究高等植物和 Galdieriapartita Rubisco 中的分子相互作用

• 发表时间: 2007
• 期刊: Biochemical and Biophysical Research Communications 第361巻
• 作者: H. Watanabe;T. Enomnoto;S. Tanaka
• 通讯作者: S. Tanaka