新しい血管新生因子VEGF受容体の遺伝子クローニングと構造及び機能解析

新型血管生成因子VEGF受体基因克隆及结构功能分析

• 批准号: 05837012
• 负责人: 榎本 平
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05837012/
• 关键词: VEGF; 血管内皮細胞; Balb; c3T3; VEGF受容体

血管内皮細胞由来細胞株Balb/c3T3を用いて、1)血管内皮細胞増殖因子VEGFの受容体遺伝子のクローニング、2)この細胞より分離したVEGF非応答細胞株Balb/c3T3TR4変異株の生化学的解析、3)この変異細胞へのVEGF受容体遺伝子の導入による細胞応答の解析を試みた。マウスおよびヒトcDNAライブラリーを用いて、VEGF受容体関連遺伝子を検索した。その結果、Balb/c3T3およびヒト血管内皮細胞で発現している未知のチロシンキナーゼ遺伝子(Vef-1と名づけた)を分離した。現在までの解析で、このVef-1は、その構造上すでに知られているVEGF受容体遺伝子fltやKDR/Flk-1と一部似ているが、明らかに異なる遺伝子であることが判明している。現在その全構造を解析中である。Balb/3T3TR4変異株のVEGFへの応答の解析から、この細胞はVEGFによる形態変化に耐性であること、VEGFによるチロシンリン酸化される蛋白のうち160kDa蛋白のリン酸化がTR4細胞では欠損していること、VEGFの細胞への結合活性は両細胞で差がないこと、などが判明した。さらに、この160kDa蛋白のリン酸化の異常は、VEGF刺激に伴う160KDa蛋白のチロシンではなくセリンリン酸化に異常があることが判明した。DNA合成への刺激に対する両細胞の応答には差がみられなかった。以上の結果より、この変異細胞TR4では、VEGFによる細胞形態変化を誘導する系に変異が起きていると考えられる。生化学的解析の結果は、その変異因子は160kDa蛋白であることを示している。また、VEGF刺激で、160kDa以外にもいくつかの蛋白がチロシンリン酸化されることが明らかになった。これらの結果は、この細胞系がVEGFのシグナル伝達の生化学的解析に有用な細胞系であることを示している。VEGFの受容体の一つflt-1を発現ベクターpSRaに組み込み、この細胞で発現させる試みも現在行っている。

1) The expression of VEGF receptor gene in vascular endothelial cell-derived cell line Balb/c3T3; 2) The isolation and biochemical analysis of VEGF non-responsive cell line Balb/c3T3TR4; 3) The expression of VEGF receptor gene in heterogeneous cells. The expression of VEGF receptor was detected by PCR. As a result, Balb/c3T3 cells were isolated from vascular endothelial cells. Now we know the VEGF receptor gene flt/KDR/Flk-1 and a part of the VEGF receptor gene flt/KDR/Flk-1. Now the whole structure is analyzed. Analysis of VEGF expression in Balb/3T3 TR4 mutant cells revealed that these cells were resistant to morphological changes in VEGF expression, and VEGF expression was resistant to acidification of the 160kDa protein. In addition, the abnormal expression of 160kDa protein and VEGF stimulation accompanied by abnormal expression of 160 kDa protein were identified. Stimulation of DNA synthesis has a profound effect on the response of cells. These results indicate that TR4, VEGF, and cell morphological changes are induced in different cell lines. The results of biochemical analysis show that the protein of 160kDa is different from that of other proteins. VEGF stimulation, protein production beyond 160kDa The results showed that the expression of VEGF in these cell lines could be analyzed by biochemical methods. VEGF receptor flt-1 expression is detected in pSRa, and the expression of VEGF in these cells is detected in these cells.

项目成果

ENOMOTO,T.: "Deficiency of tyrosine phosphorylation in a Balb/c3T3 cell variant hyper-sensitive to phorbol ester-induced cell transformation" Carcinogenesis. (in press). (1994)

ENOMOTO,T.：“对佛波酯诱导的细胞转化高度敏感的 Balb/c3T3 细胞变体中酪氨酸磷酸化的缺陷”致癌作用。

ENOMOTO.T: "Induction of membrane ruffling by growth factors in morphologically,TPA-resistant Balb/c3T3TR4 cells" Cell.Struct.Func.(in press). (1994)

ENOMOTO.T：“生长因子在形态上耐 TPA 的 Balb/c3T3TR4 细胞中诱导膜褶皱”Cell.Struct.Func.（正在印刷中）。