熱レンズ顕微鏡をベースとした単一分子測定法の創成

本研究は暗視野熱レンズ法という新しい方法論を創成して、非蛍光性分子の単一分子測定へ展開することを目的としている。昨年度は、暗視野熱レンズ顕微鏡を試作して、暗視野熱レンズ測定の原理を検証した。暗視野コンデンサからプローブ光をリング状に入射して、対向した配置で励起光を集光することで、暗視野配置の熱レンズ測定がはじめて可能になった。そこで、本年度は感度の最適化に取り組んだ。最初にパルスレーザーである励起光について、パルスの繰り返し周波数とポリスチレン粒子の信号のパルス高さについて検討した。平均出力はおよそ25kHzで最大となるが、パルス波形は検討範囲で最小の周波数である1kHzで最大となった。このことはむしろパルスあたりの出力が信号の感度に影響していることを意味している。次に、共焦点光学系によるプローブ光の検出において重要であるピンホールの径について評価した。0-600μmまでピンホールの径を変えたところ、信号強度については予想通りピンホールの径とともに単調に増加した。また、信号強度とバックグランド(迷光由来)の比には最適値が存在して、およそ100μmで最大となった。さらに流速やPMTのゲインについても検討をおこなった。以上、最適化した条件でポリスチレン粒子の粒径を下げていって、検出下限を求めた。その結果、70nmの粒子まで測定することができた。この結果は、あと2桁程度検出下限を下げられれば単一分子測定が可能であることを意味している。暗視野コンデンサのレーザー光への最適化やフォトンカウンタによる高感度化で十分に可能であると考えられる。以上により、本研究の目的である暗視野熱レンズ法による単一分子測定の可能性を示すことができた。

本研究は暗視野熱レンズ法という新しい方法論を創成して、非蛍光性分子の単一分子測定へ展開することを目的としている。昨年度は、暗視野熱レンズ顕微鏡を試作して、暗視野熱レンズ測定の原理を検証した。暗視野コンデンサからプローブ光をリング状に入射して、対向した配置で励起光を集光することで、暗視野配置の熱レンズ測定がはじめて可能になった。そこで、本年度は感度の最適化に取り組んだ。最初にパルスレーザーである励起光について、パルスの繰り返し周波数とポリスチレン粒子の信号のパルス高さについて検討した。平均出力はおよそ25kHzで最大となるが、パルス波形は検討範囲で最小の周波数である1kHzで最大となった。このことはむしろパルスあたりの出力が信号の感度に影響していることを意味している。次に、共焦点光学系によるプローブ光の検出において重要であるピンホールの径について評価した。0-600μmまでピンホールの径を変えたところ、信号強度については予想通りピンホールの径とともに単調に増加した。また、信号強度とバックグランド(迷光由来)の比には最適値が存在して、およそ100μmで最大となった。さらに流速やPMTのゲインについても検討をおこなった。以上、最適化した条件でポリスチレン粒子の粒径を下げていって、検出下限を求めた。その結果、70nmの粒子まで測定することができた。この結果は、あと2桁程度検出下限を下げられれば単一分子測定が可能であることを意味している。暗視野コンデンサのレーザー光への最適化やフォトンカウンタによる高感度化で十分に可能であると考えられる。以上により、本研究の目的である暗視野熱レンズ法による単一分子測定の可能性を示すことができた。