細胞機能を利用したο-結合型糖鎖の合成を可能にする糖鎖プライマーの開発

开发糖链引物，利用细胞功能合成 O-连接糖链

• 批准号: 17655080
• 负责人: 佐藤 智典
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17655080/
• 关键词: 糖鎖; がん細胞; 糖鎖抗原; 糖鎖プライマー; o-グリカン; 遺伝子導入; 糖鎖合成; 糖転移酵素; O-グリカン; 形質転換; 合成

O-グリカンの一つであるO-Fuc型糖鎖を糖鎖プライマー法により得ることを目指し、フコースを有した新規アミノ酸結合型プライマーFT-C11の合成を行い、CHO細胞を用いて機能解析を行った。合成したFT-C11プライマーを用いてCHO細胞への投与を行い、糖鎖伸長反応を調べた。FT-C11をCHO細胞に投与することによりプライマーが修飾を受けることが示されたが、糖鎖伸長反応は起こらなかった。CHO細胞における内在性のO-Fuc型糖鎖も多くが単糖構造であることが知られており、今回の結果でプライマーの細胞への取り込みは確認されたことから、細胞内の糖転移酵素の発現が低いことが大きな原因であると思われる。そこで、O-Fucに糖を転移する酵素Fringeの発現ベクターを作製し、CHO細胞およびCOS7細胞にFringeを一過性に発現させてFTLC11の投与を行った。細胞内のタンパク質発現は確認されたが、発現効率は低く、プライマーへの糖鎖伸長は確認できなかった。最後に、N-アセチルガラクトサミンを有したアミノ酸結合型プライマーGT-C12を急性前骨髄1生白血病細胞HL60に投与し、得られた糖鎖伸長生成物を回収・分離iし、糖鎖構造を質量分析装置(MALDI-TOF-MSおよびESI-CID-MS)を用いて決定した。これによりGT-C12はO-結合型糖鎖構造を得るためのプライマーとして機能する事が示された。

O-Fuc-type glycan chain synthesis, CHO cell function analysis, and O-Fuc-type glycan chain synthesis. The synthesis of FT-C11 protein is regulated by CHO cells. FT-C11 cells were injected with the modified protein and the glycan chain was extended. CHO cells are characterized by an intrinsic O-Fuc-type carbohydrate structure, and the results of this study confirm that the production of intracellular carbohydrate transfer enzymes is low. The enzyme Fringe was produced in CHO cells and COS7 cells. The intracellular protein expression is confirmed by low expression rate, high protein expression rate and high protein expression rate. Finally, the N-terminal glycan elongation products were isolated and analyzed by mass spectrometry (MALDI-TOF-MS and ESI-CID-MS). The GT-C12 has an O-linked sugar lock structure.