麹菌で機能するRNA干渉誘導システムの構築

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本研究では、Aspergillus属糸状菌において、その遺伝子機能の効率的な抑制技術を開発し、機能不明遺伝子の機能を明らかにする基盤技術を開発することを目的とする。本年度行った研究内容と研究成果を以下に記す。(1)RNA干渉による機能抑制標的遺伝子の決定。糸状菌では遺伝子機能が明らかにされていない推定細胞壁ストレスセンサータンパク質WscAを標的とたRNA干渉による遺伝子機能抑制を試みた。比較のためにA.nidulans wscA遺伝子破壊株を構築した。wscA破壊株では低浸透圧培地での菌糸伸長抑制、細胞壁合成阻害剤や高温に対し高感受性を示した。(2)二本鎖ヘアピンRNAを発現する糸状菌ベクターの設計・開発二本鎖ヘアピンRNA(hRNA)を発現する糸状菌ベクターを構築するため、まずA.nidulansのalcAプロモーター(PalcA)及びbipAターミネーター(TbipA)を連結した。このPalcAとTbipA間に、wscAの開始コドンから下流500bpまでの断片(A)、大腸菌uidA遺伝子の一部(B)、そしてAを逆方向(C)に順次導入し、二本鎖hRNAを発現するプラスミドベクターを構築した。また、対照としてCを含まないプラスミドを構築した。各プラスミドでA.nidulansを形質転換した。各形質転換体において、導入したプラスミドが染色体に組込まれていることを確認した。ついで、PalcAの誘導条件下で、wscAを標的としたhRNAが発現していることを確認した。しかし、標的wscA mRNAの発現量の減少は認められなかった.さらに、表現型を調べたが、wscA-hRNA発現株は、wscA遺伝子破壊株の様な表現型を示さず、野生株と同様の表現型を示した。従って、得られた形質転換体ではRNA干渉は生起していなかった。A.nidulansはRNA干渉に必要とされる遺伝子のホモログを有するが、それらのうちRdRP及びDNA helicase遺伝子の発現は十分ではなかった。RNA干渉を起こすには、これら遺伝子の発現量の調整が必要であることが示唆された。また、形質転換体の数を増やし、選抜することも重要である。