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ゲノムワイドRNA干渉スクリーニング法による腫瘍溶解RNAウイルス増殖機構の解明

利用全基因组RNA干扰筛选方法阐明溶瘤RNA病毒增殖机制

基本信息

批准号：
25430151
负责人：
井上博之
金额：
$ 3.41万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

まず、in vitro細胞傷害性試験（クリスタルバイオレット法）の結果、CVA11感染により標準治療抵抗性ヒト癌細胞であるオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞（WiDr）、トリプルネガティブ乳癌細胞(MDA-MB231及びMDA-MB432) 、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤ゲフィチニブ２次耐性小細胞肺癌細胞（H1975）あるいは乳癌MCF7細胞に対し、高い殺細胞傷害性を呈した（MOI=0.001～0.1）。次に、ハイスループットRNA干渉スクリーニング法に用いるレンチウイルスshRNAライブラリー（DCIPHER, Human module 1, 5000 gene targerts, 27,500 shRNAs）を293T細胞へトランスフェクションし構築し、上記レンチウイルスshRNAライブラリーをH1975肺腺癌及びMESO4悪性中皮腫細胞株に感染させ、各遺伝子ノックダウンした後、腫瘍溶解性RNAウイルス（CVA11）を感染させ腫瘍溶解性に抵抗性を示す癌細胞コロニーが出現することを確認した。癌細胞コロニーを回収し細胞ペレットよりRNAを抽出後、次世代シークエンスによる挿入遺伝子配列を解析した結果、VHL, BTK, IGFBP3、CARD6、MADD、TRAF4等のアポトーシスを含む細胞死関連分子及びSOX2等の幹細胞関連分子が同定された。実際に、アポトーシスを阻害する汎カスパーゼ阻害剤をCVA11感染時に併用したところ、癌細胞傷害性が有意に減少したことからアポトーシス経路がCVA11ウイルス増殖に関与している可能性が示唆された。

まず, in vitro cell damaging test (クリスタルバイオレット method), infection of CVA11 の results により standard treatment resistance ヒト cancer であるオキサリプラチン resistance (WiDr), colorectal cancer cells トリプルネガティブ breast cancer cells (MDA - MB231 and び MDA - MB432) , EGFR チロシンキナーゼ resistance against tonic ゲフィチニブ 2 patient with small cell lung cancer cells (H1975) あるいは breast cancer MCF7 cells にし seaborne, high い kill cell damage をした (MOI = 0.001 ~ 0.1). に, ハイスループット RNA dry involved スクリーニンにグ method with いるレンチウイルス shRNA ライブラリー (DCIPHER, Human module 1, 5000 gene targerts, 27500 ShRNAs) 293 t cells へをトランスフェクションし constructing し, written レンチウイルス shRNA ライブラリーを H1975 lung adenocarcinoma and び MESO4 悪 sex skin cell lines に infection in させ, all survived 伝ノックダウンした after dissolving RNA, swollen sores ウイルス (CVA11) を infection させ swollen sores Solubility に resistance を indicates す cancer cells コロニにがが appearance するするとを confirm た. Cancer cells コロニーを back 収し cells ペレットより RNA を pumped out, the next generation シークエンスによる scions into legacy 伝 with sequence analytical しをた results, VHL, BTK, IGFBP3, CARD6, MADD, TRAF4 and other <s:1> アポト and シスをシスを contain む cell death related molecules and びSOX2 and other <s:1> stem cell related molecules が and された. Be interstate に, アポトーシスを resistance against する generic カスパーゼ resistance against tonic を CVA11 infection に and したところ, cancer cell damaging が intentionally に reduce したことからアポトーシス経 road が CVA11 ウイルス raised colonization に masato and していがる possibility in stopping された.