蛍光標識化MRP4/ABCC4を用いた新薬スクリーニング系の開発

利用荧光标记MRP4/ABCC4开发新药筛选系统

• 批准号: 17659041
• 负责人: 寺崎 哲也
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17659041/
• 关键词: トランスポーター; 蛍光消光法; 薬物分布; ABCトランスポーター; 基質認識; MRP4; MIANS; High Throughput Screenint

MRP4の基質認識特性を解明するために、立体構造感受性蛍光色素を用いた基質とトランスポーターの相互作用検出系の構築を行った。ヒトcDNAライブラリーからヒトMRP4の全長の単離し、MIANSを導入するための変異の導入に成功した。変異体MRP4を大量発現している膜画分を得るために、作成した変異体MRP4遺伝子をヒト胎児腎臓細胞(HEK293細胞)に導入し、安定発現株を作成した。膜小胞を作成し、変異体の活性をATPase活性とFACSを用いた蓄積度から解析した結果、変異体は野生型と同様の基質認識性を有していることが明らかになった。膜小胞の溶液にMIANSを添加し反応させ、反応液をゲルろ過カラムに通し、90%以上の膜小胞を回収し、未反応MIANSを除去することに成功した。MIANSを反応させた改変ABCC4を含む膜小胞溶液にヒトABCC4基質を順次濃度を上昇し添加し、各添加時の蛍光強度を測定した結果、基質濃度に従って蛍光光度の低下が認められた。複数の基質を用いて蛍光を計測し、濃度に対して蛍光減少率のグラフを作成した結果、基質認識に飽和性が認められることを確認した。さらに、親和性を示すKm値は、膜小胞を用いた輸送実験で報告されているKm値と非常に近い値となった。この結果は、MIANSを反応させた変異型ヒトABCC4を含む膜小胞溶液を用いることによって、ヒトABCC4の基質親和性を測定が可能であることを示している。本技術は、基質とトランスポーターの相互作用を簡便に測定できる系として、非常に重要な基盤技術である。

MRP4 の substrate know を interpret す る た め に, three-dimensional structure sensitivity 蛍 photopigment を with い た matrix と ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 検 interaction is の build を row っ た. ヒ ト cDNA ラ イ ブ ラ リ ー か ら ヒ ト MRP4 の span の 単 し, MIANS を import す る た め の - different の import に successful し た. - variant MRP4 を large 発 now し て い る membrane draw points を る た め に, consummate し た - variant MRP4 heritage 伝 son を ヒ ト tire where crucial kidney cells (HEK293 cells) に import し, stable 発 strains を now done し た. Small cell membrane を し, consummate - variant の active を と ATPase activity both FACS を with い た accumulation degrees か ら parsing し た results, variations variants は wild-type と with others is の matrix recognition を have し て い る こ と が Ming ら か に な っ た. Small cell membrane の solution に MIANS を add し anti 応 さ せ, anti 応 を ゲ ル ろ too カ ラ ム に し, more than 90% の membrane vesicular を back 収 し, not reverse 応 MIANS を remove す る こ と に successful し た. MIANS を anti 応 さ せ た change - ABCC4 を vesicular solution containing む membrane に ヒ ト ABCC4 matrix を progressive concentration を rise when adding し, each adding し の 蛍 light intensity を determination し た results, substrate concentration に 従 っ て 蛍 light low luminosity の が recognize め ら れ た. Plural を の matrix with い て 蛍 を light measuring し, concentration に し seaborne て 蛍 light loss の グ ラ フ を made し た results, understanding に saturated が recognize め ら れ る こ と を confirm し た. さ ら に, affinity を す Km numerical は, small cell membrane を with い た delivery be 験 で report さ れ て い る Km on numerical と very nearly い に numerical と な っ た. こ の results は, MIANS を anti 応 さ せ た - alien ヒ ト ABCC4 を containing む を small cell membrane solution with い る こ と に よ っ て, ヒ ト ABCC4 の substrate affinity を determination が may で あ る こ と を shown し て い る. This technical は, matrix と ト ラ ン ス ポ ー タ ー の easy interaction を に determination で き る department と し て, very important な に base plate technology で あ る.