新規微量プロテインフォスファターゼ群の分子クローニングと機能解析

ウサギの脳、心臓、腎臓、肝臓、骨格筋などの臓器をホモゲナイズして得られた抽出液を、それぞれ1型および2A型プロテインフォスファターゼ(PP1とPP2A)の高親和性阻害剤の一つであるミクロシスチンLR(MCLR)をリガンドとしたアフィニティカラム(現有)に通し、PP 1/PP2Aを除去したのち、液体クロマトグラフィ (LQ)(イオン交換LQ,疎水性LQ,ゲル濾過)にかけ、得られた分画についてPP活性を測定した。基質としては32P・燐酸化蛋白(カゼイン、ミオシン軽鎖、フォスフォリラーゼ、ピストンなど)の他、人工の発色基質(ρ-ニトロフェニル燐酸)などを試みた。検出された酵素活性について、陽イオン要求性、阻害剤感受性[酒石酸、プロモテトラミゾール、アントラセン-9-カルボン酸(9AC)など]に基づいて新規PPを含む分画の同定を試みた。特に、9AC感受性分画を中心に二次元電気泳動や分取用等電点電気泳動装置を用いた酵素蛋白の精製を進め、目的とする酵素蛋白が二次元電気泳動により単一スポットとして泳動される程度に精製した。さらに、そのような試料についてN末のアミノ酸分析を行い、その配列情報をもとにdegenerated primerを設計してPCRを行い、全cDNA配列の決定に努めている。今後、9AC感受性PPのcDNA全配列の決定とそれに基づいた発現系の確立を目指す。また、9AC感受性PP以外のPP活性を持つ分画に関しても同様の分析を進める。なお、上記と並行してこれまで成功した例のない、大腸菌におけるPP2Aの大量発現系の構築を試みた。まだフォスファターゼ活性のある酵素の発現には至っていないが、2つの調節性サブユニットや分子シャペロンとの共発現により、従来より格段に多いPP2A蛋白の発現をおこすことができるようになった。

ウサギの脳、心臓、腎臓、肝臓、骨格筋などの臓器をホモゲナイズして得られた抽出液を、それぞれ1型および2A型プロテインフォスファターゼ(PP1とPP2A)の高親和性阻害剤の一つであるミクロシスチンLR(MCLR)をリガンドとしたアフィニティカラム(現有)に通し、PP 1/PP2Aを除去したのち、液体クロマトグラフィ (LQ)(イオン交換LQ,疎水性LQ,ゲル濾過)にかけ、得られた分画についてPP活性を測定した。基質としては32P・燐酸化蛋白(カゼイン、ミオシン軽鎖、フォスフォリラーゼ、ピストンなど)の他、人工の発色基質(ρ-ニトロフェニル燐酸)などを試みた。検出された酵素活性について、陽イオン要求性、阻害剤感受性[酒石酸、プロモテトラミゾール、アントラセン-9-カルボン酸(9AC)など]に基づいて新規PPを含む分画の同定を試みた。特に、9AC感受性分画を中心に二次元電気泳動や分取用等電点電気泳動装置を用いた酵素蛋白の精製を進め、目的とする酵素蛋白が二次元電気泳動により単一スポットとして泳動される程度に精製した。さらに、そのような試料についてN末のアミノ酸分析を行い、その配列情報をもとにdegenerated primerを設計してPCRを行い、全cDNA配列の決定に努めている。今後、9AC感受性PPのcDNA全配列の決定とそれに基づいた発現系の確立を目指す。また、9AC感受性PP以外のPP活性を持つ分画に関しても同様の分析を進める。なお、上記と並行してこれまで成功した例のない、大腸菌におけるPP2Aの大量発現系の構築を試みた。まだフォスファターゼ活性のある酵素の発現には至っていないが、2つの調節性サブユニットや分子シャペロンとの共発現により、従来より格段に多いPP2A蛋白の発現をおこすことができるようになった。