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HPLCを用いた16SrRNAの高次構造多型の解析による細菌同定方法の研究

HPLC分析16S rRNA构象多态性细菌鉴定方法研究

基本信息

批准号：
17659168
负责人：
河野緑
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Jikei University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17659168/
关键词：
核酸細菌リボゾーマルRNA HPLC

项目摘要

アフィニティカラムを利用した16SrRNA分子の単離方法の確立:昨年度作成し、実験を行ったプローブの位置は細菌の共通配列としては保存性が最も高く最適であるが、カラムへのアフィニティ効率が低いことが判明した。理由は16SrRNA分子の立体構造が障害となりカラム上のプローブに16SrRNA分子内の目的の配列がうまく到達しないためと考え、16SrRNA分子の末端位置でのプローブの設計を行った。5‘末端側の位置および3'末端側の位置の配列を利用したプローブを作成し、アフィニティ効率の比較実験を行った。具体的には(1)5｀末端側のプローブUp35(Tm=75.4)をつけたアフィニィティカラムの設計および作成(2)3'末端側のプローブLo27(Tm=75.9)のカラムの設計および作成(3)上記の2種類プローブを等量づつ混合したアフィニィティカラムの作成を行い、検討にはE.Coli DNAよりPCR法による増幅産物1,500bp 16SrDNA分子を用いた。その結果、(2)3'末端側のプローブの効率が高いことが判明した。上記、選定を行ったプローブ位置での16SrRNA分子の溶離条件の検討を行った。1,500bp 16SrDNA分子では、NaCl塩濃度0.3M,温度勾配8.75℃/min(55℃から90℃),流速0.1mL/minの条件が最も効率よく溶離できた。また、16SrRNA分子ではNaCl塩濃度0.15M,温度勾配10℃/min(55℃から95℃),流速0.1mL/minの条件が効率よく溶離できた。細菌RNA分子の抽出にはSV total RNA Isolation System(Promega)を用いた。送液装置の改良:送液部分をメタルフリーに改良した結果、溶離液中のEDTAと金属の反応が解消され、サンプルに蛍光ラベルの必要がなくなり、高分子核酸をintactな状態で溶離することが可能となった。

The method of isolation of 16S rRNA molecules was established in the past year, and the common arrangement of bacteria in the past year was determined. The reason is that the stereo structure of 16SrRNA molecule is difficult to achieve, and the design of the terminal position of 16SrRNA molecule is difficult to achieve. The position of the 5 'end side and the position of the 3' end side are arranged in a way that makes use of the position of the 5 'end side and the position of the 3' end side. Specific (1)5`End Side (Tm=75.4)(Tm=75.9) The design and preparation of the template (3) The preparation of the template was carried out by mixing the two types of template described above in equal amounts, and the amplification product of E.Coli DNA PCR method was discussed. As a result, it was found that (2) the efficiency of the plug on the 3'end side is high. In this paper, we discuss the conditions for the dissolution of 16SrRNA molecules at the selected positions. 1, 500bp 16SrDNA molecule was dissolved in NaCl solution at 0.3M, temperature at 8.75℃/min(55℃ ~ 90℃) and flow rate at 0.1mL/min. Under the conditions of NaCl concentration of 0.15M, temperature adjustment of 10℃/min(55℃ ~ 95℃) and flow rate of 0.1mL/min, the dissolution rate of 16SrRNA molecules was obtained. Bacterial RNA Extraction and Total RNA Isolation System(Promega) The improvement of the liquid feeding device: the improvement of the liquid feeding part, the elimination of EDTA and metal in the solution, the necessity of the solution, and the possibility of the dissolution of the polymer nucleic acid in the intact state.