B型肝炎ウイルスのコードするmicroRNAの検索

(1)microRNAのライブラリー作成HBVゲノムが組み込まれている肝癌細胞株を用いることで、肝癌組織に存在するB型肝炎ウイルスゲノムからmicroRNAをスクリーニングした。すなわち、肝癌細胞株から、17〜25塩基のRNAをアクリルアミド・ゲルで抽出し、5'、3'端にアダプターを付加後、逆転写反応を行いcDNAを作成し、制限酵素配列(BanI)を付加したプライマーでPCR反応後、制限酵素切断、ライゲーションした。500-1,000塩基の断片を抽出、tailing後、TA cloningにてライブラリーを作成した。(2)HBVのゲノムにコードされたmicroRNAの塩基配列の決定ライブラリーの数百のバクテリア・コロニーからプラスミドを精製し、挿入された塩基配列を決定し、アダプターに挟まれた17〜25塩基配列が、HBVのゲノム配列と相同性を持つかどうかに関して検索した。(3)HBVのゲノムにコードされたmicroRNAの発現の検討昨年に引きつづき、相同性を持つ塩基配列を含む近傍のHBVゲノムがstem loop構造を取りうること、相同性を持つ塩基配列が肝癌細胞株で発現があることを調べるべく実験を予定したが、肝癌からHBVのゲノム配列と相同性を持つ塩基配列は得られなかった。ヒト肝癌組織やB型肝炎患者肝組織から(1)〜(3)と同様の検討を今後改めて行う予定にしており、今回の肝癌細胞株を用いた検討は今回で終了とする。

(1)microRNAのライブラリー作成HBVゲノムが組み込まれている肝癌細胞株を用いることで、肝癌組織に存在するB型肝炎ウイルスゲノムからmicroRNAをスクリーニングした。すなわち、肝癌細胞株から、17〜25塩基のRNAをアクリルアミド・ゲルで抽出し、5'、3'端にアダプターを付加後、逆転写反応を行いcDNAを作成し、制限酵素配列(BanI)を付加したプライマーでPCR反応後、制限酵素切断、ライゲーションした。500-1,000塩基の断片を抽出、tailing後、TA cloningにてライブラリーを作成した。(2)HBVのゲノムにコードされたmicroRNAの塩基配列の決定ライブラリーの数百のバクテリア・コロニーからプラスミドを精製し、挿入された塩基配列を決定し、アダプターに挟まれた17〜25塩基配列が、HBVのゲノム配列と相同性を持つかどうかに関して検索した。(3)HBVのゲノムにコードされたmicroRNAの発現の検討昨年に引きつづき、相同性を持つ塩基配列を含む近傍のHBVゲノムがstem loop構造を取りうること、相同性を持つ塩基配列が肝癌細胞株で発現があることを調べるべく実験を予定したが、肝癌からHBVのゲノム配列と相同性を持つ塩基配列は得られなかった。ヒト肝癌組織やB型肝炎患者肝組織から(1)〜(3)と同様の検討を今後改めて行う予定にしており、今回の肝癌細胞株を用いた検討は今回で終了とする。