新たに開発されたレドックス・プローブをもちいた新しい臓器機能評価法の開発

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レドックス感受性プローブ細胞内GSH/GSSG比を反映するレドックス感受性プローブは、GFP(Green Fluorescent Protein)をもとに作られ、細胞内の生理的あるいは病的状態における、酸化あるいは還元状態に発光強度が変化するよう設計した。さらに、プローブをプラスミドからアデノウィルスベクターに組み込んだ。細胞導入実験ベクターを用いて、Hela細胞(ヒト扁平上皮癌細胞株)、AML12(非腫瘍性肝細胞株)にtransient transfectionし、プローブ蛋白を発現させた。その後、共焦点レーザー顕微鏡にて観察し発現を確認した。(400nmおよび480nmの2波長にてそれぞれ励起し、535nmの吸収を観察)a)酸化剤(aldrithiol)および還元剤(DTT)を投与し、細胞内に発現したroGFPプローブが予想通りに機能するかどうかを確認した。roGFPは、酸化剤・還元剤により変化し、この変化は可逆的であった。b)酸化ストレスを誘導する刺激として低酸素・再酸素化ストレスをくわえる実験をおこなった。その結果、低酸素中、細胞内は徐々に還元状態に傾くが低酸素状態が2時間を越えると低酸素状態にあるにもかかわらず酸化ストレスがかかることを観察した。再酸素化後は一気に酸化的ストレスがかかり、そのピークは10-15分後にあり、60分以内に酸化ストレスはべースラインに戻ることが観察された。このプローブは、生理的状態下でも可逆的に細胞内酸化・還元状態を示すことが可能であった。c)現在このGFP redoxプローブをもちいて、種々の抗酸化剤(SOD、Ref-1、NACなど)の評価を行なっている。d)また、新たにCaspase-3のプローブを作成中であり、酸化ストレスと細胞死(アポトーシス)の関係を検討する準備をしている。