土壌における芳香族化合物分解の評価に機能遺伝子データを網羅的に用いる手法の開発

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本年度は、昨年度の成果であるプローブの設計条件とマイクロアレイとしての特異性についての知見に基づき、土壌中でのベンゼン分解に関与する遺伝子群網羅的にかつ特異的に検出するための検討を行った。さらに、実際の土壌試料に対して作成したマイクロアレイを適用し、土壌中におけるベンゼン分解遺伝子の網羅的検出を試みた。まず、昨年度までに扱ったベンゼンモノオキシゲナーゼと同様の手法で残りのベンゼン分解遺伝子であるベンゼンジオキシゲナーゼについてクローン解析を行い、ペンゼンジオキシゲナーゼの多様性と遺伝子データペースを拡充した。得られた遺伝子データベースをもとに、遺伝子プローブの網羅的設計を行った。この際の遺伝子プローブの設計条件として昨年度の成果を生かし、標的との相同塩基数が58/60塩基対以上、非標的とは相同性が54/60塩基対以下、ストレッチが20塩基対以下の条件下での設計を行うことで、より網羅的な設計を行うことができた。また、ベンゼンモノオキシゲナーゼ遺伝子についても同様の条件で再度設計を行うことにより、可能な限りのプローブを設計した。設計されたプローブ群をすべて1枚のマイクロアレイとして積載した、ベンゼン分解遺伝子全体を網羅的に検出するためのマイクロアレイを作成し、再度マイクロアレイの特異性についての検討を行った。これらの検討により、微生物の異化的代謝に関与する遺伝子をマイクロアレイで検出・解析する上で、網羅性と特異性を両立させるために上記の条件が適していることが示され、可能性と限界について提示することができた。また、ベンゼン汚染土壌などを含む実際の土壌試料数種類を用いて、設計したアレイによる解析を行った。その結果、土壌中のベンゼン分解遺伝子は非常に多様であることが示された反面、すべての試料で同一の遺伝子が検出され、土壌中のベンゼン分解において重要な役割を示すものであると考えられた。