微生物叢ゲノム断片アイソトープアレイによる環境汚染物質分解微生物の特定技術の開発

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本年度の研究では、ショットガンアレイにおいて1)さらに近縁な微生物種間の検出における特異性について検討するとともに、アイソトープアレイにおいて2)得られたシグナルが本当に基質を資化した微生物由来のシグナルであるかを検証した。1)ショットガンアレイの特異性に関する検討については、同一の属(Pseudomonas属)に属し、互いの遺伝学的類似度が異なる4種の純菌株を用いた検討を行った。ゲノムDNAを断片化、クローニングを行い、1枚のメンブレンにスポットしたショットガンアレイを作成したのち、上記の純菌株由来のDNA断片をハイブリダイゼーションさせた。その結果、同属異種の菌株においては、高度に保存されているrrnオペロン配列では特異的な検出は不可能であるものの、そのほかの配列では条件を厳しくすることにより、特異的なシグナルを非特異的なものと比べ10倍以上の強度で得ることができることを明らかにした。2)アイソトープアレイで得られるシグナルの検証活性汚泥に対して放射性同位体標識した酢酸、メタノールを投与し、同一試料から抽出したDNAによるアレイとハイブリダイズさせて得られたシグナルのスポットについて、安定同位体プローブ法(SIP法)を用いて各基質を資化する微生物であるかどうかを検証した。5個の陽性プローブと4個の陰性プローブについて塩基配列を解読し、各塩基配列を用い、当該DNAの存在を定量的に測定できるプライマーを設計した。この特異的なPCRプライマーを用い、定量PCR法によりSIP法によって分離した各画分のDNAを定量し、標識基質のDNAへの取り込みを調べたところ、1つを除き検出結果が正しいことを検証した。この結果より、ショットガンアイソトープアレイ法が実際の微生物生態系において、基質を資化した微生物を特異的に検出できる手法であることを示すことができた。以上の結果により、クロスハイブリダイゼーションによる誤陽性の可能性を明らかにするとともに最小限に抑えたうえで、アイソトープアレイによる実環境試料の解析例を、その信頼性とともに示すことができた。