光照射により誘導される、細胞単位でのDNA組換えシステムの開発

光照射诱导的基于细胞的 DNA 重组系统的开发

• 批准号: 18657005
• 负责人: 神吉 浩明
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18657005/
• 关键词: ゲノム構築・機能・再編・発現・維持; マウス; ノックアウト; Cre-loxP

本研究では、蛍光蛋白・Kikume Green-Red(KikGR)の「ある特定波長の光の照射を受けると切断される」という性質を利用し、光照射によって細胞単位でCre-loxPシステムによるDNA組換えを誘導するシステムの構築を目指した。簡単には、KikGRとDNA組換え酵素Creの融合蛋白を細胞膜に固定しておき、それに光を照射することによって、KikGR部位が切断されてCre部位が遊離し、Cre内在性の核移行シグナルによって核へ移動し、ゲノムDNA中のCre認識配列・loxPペアに挟まれた領域を組換える、という機構である。本年度は、昨年度中に準備した(1)哺乳類用にコドン最適化したKikGRの発現コンストラクト(paCre)、及び(2)DNA組換え検出用細胞株(293T/lacZ及び293T/Venus)を用いて、実際に光照射によりDNA組換えを誘導することができるかどうかを検討した。まず、上記DNA組換え検出用細胞株にpaCreをトランスフェクトし、このプラスミドが導入された細胞でのKikGRの発現を緑色蛍光で確認した。次に、蛍光顕微鏡下で適当なフィルターを用いて、得られたダブル・トランスフェクタントにphotoconversion用光を照射し、KikGR蛍光の緑→赤変換を確認した。しかしながら、その後種々のパラメーターを変えて条件検討を繰り返したものの、lacZ、Venusいずれのレポーター遺伝子の発現も残念ながら観察することができなかった。また、更に感度の高いPCR法でもDNA組換えは検出できなかった。よって、このシステムの確立には更なる改良が必要であると思われる。

This study で は, 蛍 light protein Kikume Green - Red (KikGR) の "あ る specific wavelength の の sunlight を by け る と cut さ れ る" と い う properties using を し, light に よ っ て cells 単 a で Cre - loxP シ ス テ ム に よ る DNA group in え を induced す る シ ス テ ム の build を refers し た. Jane 単 に は, KikGR と group in え DNA enzyme Cre の を membrane fusion protein に fixed し て お き, そ れ に を sunlight す る こ と に よ っ て and KikGR が cut さ れ て が Cre parts free し, Cre internality の nuclear migration シ グ ナ ル に よ っ て nuclear へ mobile し, ゲ ノ ム DNA の Cre understanding of le lo xPペアに replaces the まれた field を group with える and と う う institutions である. に は this year and last year in preparation for し た (1) mammals with に コ ド ン optimization し た KikGR の 発 now コ ン ス ト ラ ク ト (paCre), and び group (2) DNA in え 検 out cell lines (293 t / 293 t/Venus lacZ and び) を with い て, be interstate に light に よ り DNA group in え を induced す る こ と Youdaoplaceholder0 がで る る る う う を検 を検 ask for た. ま ず, written in the DNA in え 検 out cell lines に paCre を ト ラ ン ス フ ェ ク ト し, こ の プ ラ ス ミ ド が import さ れ た cells で の KikGR の 発 を 蛍 green light now で confirm し た. に, 蛍 light 顕 micromirror で under appropriate な フ ィ ル タ ー を with い て, ら れ た ダ ブ ル · ト ラ ン ス フ ェ ク タ ン ト に photoconversion light し を exposure, KikGR 蛍 の light green - red - in を confirm し た. し か し な が ら, そ の after a 々 の パ ラ メ ー タ ー を - え 検 て conditions for を Qiao り return し た も の の, lacZ, Venus い ず れ の レ ポ ー タ ー posthumous son 伝 の 発 now も remnants read aloud な が ら 観 examine す る こ と が で き な か っ た. Youdaoplaceholder0, more に sensitivity <s:1> high <s:1> PCR method で <s:1> DNA group exchange え え 検 検 to で で な な った った った った. Youdaoplaceholder0, われる システム システム システム システム establish に に more なる improve が necessary であると think われる.