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霊長類キメラ酵素を用いた環境中化学物質の代謝に与るグルクロン酸転移酵素の機能解明

使用灵长类嵌合酶阐明参与环境化学物质代谢的葡萄糖醛酸基转移酶的功能

基本信息

批准号：
18659032
负责人：
成松鎮雄
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度に引き続き、カニクイザルのグルクロン酸転移酵素(UGT)の遺伝子クローニング及び異種細胞現系でのタンパク質発現系構築を進めた。またUGTキメラ酵素作成のためにの手始めとして、同じマーモセットからすでにクローニングをしていたCYP2D19とヒトCYP2F6のキメラ酵素作成も同時に進めた。両酵素間では基質であるデブリソキンの酸化反応の位置選択性が異なっていることを指標に、それぞれをコードしているcDNAを制限酵素により3分割して、交換してつなぎ合わせA、BおよびCの3種のキメラcDNAを作成し、酵母細胞に導入し、キメラ酵素タンパク質を発現させた。その酵素機能を検討することにより、ヒトおよびマーモセットCYP2D酵素の独自のデブリソキンの酸化反応の位置選択性を決定する部分構造を確認した。この結果を踏まえて、ヒトUGT2B15と、その相同酵素である力ニクイザルUGT2B20のcDNAクローニングを行い、それぞれ酵母細胞に導入して酵素タンパク質を発現させ、7-ヒドロキシトリフルオロクマリン(7-HTFMC)を基質にしてその酵素機能を調べた。酵素活性はUGT2B15<<UGT2B20であり、キメラ酵素作成に適していることが分かった。上記のCYP2D酵素の例に倣ってこれら2種のUGTをコードするcDNAを制限酵素で2分割して、A(N-末端部位がUGT2B15CでC-末端部位がUGT2B20)とB(N-末端部位がUGT2B20でC-末端部位がUGT2B15)の2種類のキメラcDNAを作成し、酵母細胞に導入してキメラ酵素タンパク質を発現させた。しかしながら、この条件ではいずれのキメラ酵素タンパク質も十分な酵素活性を有していなかった。そこで、現在、発現系を酵母細胞からCOS-7細胞に代えて、発現を試ており、その結果が待たれるところである。

In the past year, the construction of a new generation system for the expression of UGT and heterogeneic cell lines has been advanced. The UGT enzyme is created by hand, and the CYP2D19 and CYP2F6 enzyme are created by hand. The position selectivity of the acidizing reaction between enzymes is different, and the index is different. The cDNA of the enzyme is restricted. The cDNA of A and B is divided into three parts. The cDNA of A and B is introduced into yeast cells. The enzyme is developed. The function of CYP2D enzyme is discussed, and the structure of CYP2D enzyme is confirmed. The results were as follows: 1. UGT2B15, 2. cDNA library of UGT2B20, 3. enzyme quality development in yeast cells, 7-HTFMC (7-HTFMC), 3. enzyme function modulation in substrate. Enzyme activity is UGT2B15<<UGT2B20 Examples of CYP2D enzymes described above include two types of UGT cDNA restriction enzymes, two types of A(N-terminal site: UGT2B15C; C-terminal site: UGT2B20) and two types of B(N-terminal site: UGT 2B20 C-terminal site: UGT2B15) cDNA restriction enzymes, and yeast cell introduction. The enzyme activity of the enzyme is very high. The yeast cells, COS-7 cells, and the results of the experiments were obtained.