非侵襲的脊髄遺伝子導入による新たな疼痛治療戦略の開発

平成18年度の研究により、プラスミドDNAと微小気泡の混合液をマウス脊髄くも膜下腔へ注入し、超音波を照射することにより脊髄硬膜組織へ目的とする遺伝子を導入ができることを確認した。この結果を踏まえて、19年度は以下のような研究を行った。1.内因性オピオイドのひとつであるβエンドルフィンの前駆物質プロピオメラノコルチン(POMC)遺伝子を含むプラスミドベクターを作成した(インビトロゲン社製)。このベクターが供与する核酸は以下のとおりである。マウスcDNA(POMC遺伝子)、ヒトゲノムDNA(EFIαプロモーター)、サイトメガロウイルス(CMV)IEプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、オワンクラゲ緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子及びその変異体。2.培養細胞(ヒト胎児腎細胞由来)に作製したプラスミドを上記の方法で物理的に導入し、GFP発光を確認した。3.マウス(BALB/c雄6〜8週)をペントバルビタール腹腔内麻酔後、L4-5問より27G注射針で髄腔内にプラスミドDNAと微小気泡(診断用超音波造影剤アルブミンバブルOptisonTM)の混合液10μlを経皮的に注入し、直ちに水中で刺入部脊椎に垂直に超音波を照射した。3.照射3日後に、von Frey線維による痛覚閾値と赤外線熱刺激装置による温覚閾値の測定をマウス後脚で行った。しかし、いずれも閾値も対照マウスとの差が認められなかった。また、摘出脊髄標本でもGFPの発光が確認できなかった。この理由としては、遺伝子導入効率が低い可能性や導入されたPOMCからβエンドルフィンが産生されていない可能性が考えられた。

平成18年度の研究により、プラスミドDNAと微小気泡の混合液をマウス脊髄くも膜下腔へ注入し、超音波を照射することにより脊髄硬膜組織へ目的とする遺伝子を導入ができることを確認した。この結果を踏まえて、19年度は以下のような研究を行った。1.内因性オピオイドのひとつであるβエンドルフィンの前駆物質プロピオメラノコルチン(POMC)遺伝子を含むプラスミドベクターを作成した(インビトロゲン社製)。このベクターが供与する核酸は以下のとおりである。マウスcDNA(POMC遺伝子)、ヒトゲノムDNA(EFIαプロモーター)、サイトメガロウイルス(CMV)IEプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、オワンクラゲ緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子及びその変異体。2.培養細胞(ヒト胎児腎細胞由来)に作製したプラスミドを上記の方法で物理的に導入し、GFP発光を確認した。3.マウス(BALB/c雄6〜8週)をペントバルビタール腹腔内麻酔後、L4-5問より27G注射針で髄腔内にプラスミドDNAと微小気泡(診断用超音波造影剤アルブミンバブルOptisonTM)の混合液10μlを経皮的に注入し、直ちに水中で刺入部脊椎に垂直に超音波を照射した。3.照射3日後に、von Frey線維による痛覚閾値と赤外線熱刺激装置による温覚閾値の測定をマウス後脚で行った。しかし、いずれも閾値も対照マウスとの差が認められなかった。また、摘出脊髄標本でもGFPの発光が確認できなかった。この理由としては、遺伝子導入効率が低い可能性や導入されたPOMCからβエンドルフィンが産生されていない可能性が考えられた。