リンパ管内皮細胞を標的とした再生治療 〜不死化細胞樹立と機能するリンパ網の作成〜

我々は、商業ベースで入手したヒト新生児真皮由来リンパ管内皮細胞を不死化させる目的で、当初、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素hTERTの遺伝子導入を計画したが、諸般の事情により、SV40LargeT抗原の遺伝子導入を試みた。用いたベクターは温度感受性SV40LargeT抗原をもつウイルスベクターであり、33℃では活性化(不死化)するが、39℃では抗原は不活化する。リポフェクション法による遺伝子導入後、アンピシリンによるセレクションを行った。その後、継代したリンパ管内皮細胞において、RT-PCR法を行ったが、リンパ管マーカー(Prox-1.Podoplanin,VEGFR-3)の発現を確認することはできなかった。しかし遺伝子導入を行わなかったリンパ管内皮細胞において、RT-PCR法により、リンパ管マーカーの発現は、初代より第5継代までは維持していることが確認されたため、第3、第4代のリンパ管内皮細胞を用いて実験を継続した。三次元リンパ網モデルの作成は、ブタ腱由来酸可溶性タイプIコラーゲン(セルマトリックス;新田ゼラチン)を用いて行った。12ウエルプレートにタイプIコラーゲンをコートして細胞を播種し、24時間後にタイプIコラーゲンをのせ、リンパ管内皮細胞を上層と下層でサンドイッチ状にはさみこむように培養した。予め、リンパ管内皮細胞をdiIで標識することにより、48時間後、共焦点蛍光顕微鏡下にリンパ網の形成をを確認することができた。現在、このリンパ網が管腔構造を形成しているのか電子顕微鏡で確認している。

我々は、商業ベースで入手したヒト新生児真皮由来リンパ管内皮細胞を不死化させる目的で、当初、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素hTERTの遺伝子導入を計画したが、諸般の事情により、SV40LargeT抗原の遺伝子導入を試みた。用いたベクターは温度感受性SV40LargeT抗原をもつウイルスベクターであり、33℃では活性化(不死化)するが、39℃では抗原は不活化する。リポフェクション法による遺伝子導入後、アンピシリンによるセレクションを行った。その後、継代したリンパ管内皮細胞において、RT-PCR法を行ったが、リンパ管マーカー(Prox-1.Podoplanin,VEGFR-3)の発現を確認することはできなかった。しかし遺伝子導入を行わなかったリンパ管内皮細胞において、RT-PCR法により、リンパ管マーカーの発現は、初代より第5継代までは維持していることが確認されたため、第3、第4代のリンパ管内皮細胞を用いて実験を継続した。三次元リンパ網モデルの作成は、ブタ腱由来酸可溶性タイプIコラーゲン(セルマトリックス;新田ゼラチン)を用いて行った。12ウエルプレートにタイプIコラーゲンをコートして細胞を播種し、24時間後にタイプIコラーゲンをのせ、リンパ管内皮細胞を上層と下層でサンドイッチ状にはさみこむように培養した。予め、リンパ管内皮細胞をdiIで標識することにより、48時間後、共焦点蛍光顕微鏡下にリンパ網の形成をを確認することができた。現在、このリンパ網が管腔構造を形成しているのか電子顕微鏡で確認している。