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リンパ管内皮細胞を標的とした再生治療〜不死化細胞樹立と機能するリンパ網の作成〜

以淋巴内皮细胞为目标的再生治疗 - 永生化细胞的建立和功能性淋巴网络的创建 -

基本信息

批准号：
18659522
负责人：
古川洋志
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18659522/
关键词：
リンパ管内皮細胞 LEC リンパ管マーカー不死化

项目摘要

我々は、商業ベースで入手したヒト新生児真皮由来リンパ管内皮細胞を不死化させる目的で、当初、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素hTERTの遺伝子導入を計画したが、諸般の事情により、SV40LargeT抗原の遺伝子導入を試みた。用いたベクターは温度感受性SV40LargeT抗原をもつウイルスベクターであり、33℃では活性化(不死化)するが、39℃では抗原は不活化する。リポフェクション法による遺伝子導入後、アンピシリンによるセレクションを行った。その後、継代したリンパ管内皮細胞において、RT-PCR法を行ったが、リンパ管マーカー(Prox-1.Podoplanin,VEGFR-3)の発現を確認することはできなかった。しかし遺伝子導入を行わなかったリンパ管内皮細胞において、RT-PCR法により、リンパ管マーカーの発現は、初代より第5継代までは維持していることが確認されたため、第3、第4代のリンパ管内皮細胞を用いて実験を継続した。三次元リンパ網モデルの作成は、ブタ腱由来酸可溶性タイプIコラーゲン(セルマトリックス;新田ゼラチン)を用いて行った。12ウエルプレートにタイプIコラーゲンをコートして細胞を播種し、24時間後にタイプIコラーゲンをのせ、リンパ管内皮細胞を上層と下層でサンドイッチ状にはさみこむように培養した。予め、リンパ管内皮細胞をdiIで標識することにより、48時間後、共焦点蛍光顕微鏡下にリンパ網の形成をを確認することができた。現在、このリンパ網が管腔構造を形成しているのか電子顕微鏡で確認している。

In order to prevent the death of neonatal dermis derived from vascular endothelial cells, we have developed a new method of gene introduction of SV40 LargeT antigen. The temperature sensitive SV40 LargeT antigen is activated at 33℃ and inactivated at 39℃. After the introduction of the gene, the gene is transferred to the gene. The expression of Prox-1.Podoplanin, VEGFR-3 in endothelial cells was confirmed by RT-PCR. When the gene was introduced into vascular endothelial cells, RT-PCR was used to detect the presence of vascular endothelial cells. It was confirmed that the third and fourth generations of vascular endothelial cells were actually used. The three-dimensional network is made into a three-dimensional network. The tendine-derived acid is soluble in water. 12 hours after seeding, 24 hours after seeding, endothelial cells were cultured in the upper and lower layers. After 48 hours, the formation of the endothelial cell network was confirmed by confocal microscopy. Now, the formation of this network lumen structure has been confirmed by electron microscopy.